Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal
Summary
Aquí, entregamos imitaciones exógenas de miARN sintetizadas artificialmente al riñón a través de la inyección de venas de cola de un vector no viral y nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal. Esto condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en el riñón, lo que resultó en una progresión inhibida de la enfermedad renal en varios modelos de ratón.
Abstract
Los microARN (miARN), pequeños ARN no codificantes (21-25 bases) que no se traducen en proteínas, inhiben muchos ARN mensajeros diana (ARNm) al desestabilizar e inhibir su traducción en diversas enfermedades renales. Por lo tanto, la alternancia de la expresión de miARN por imitadores de miARN sintetizados artificialmente exógenos es una opción de tratamiento potencialmente útil para inhibir el desarrollo de muchas enfermedades renales. Sin embargo, debido a que la ARNasa sérica degrada inmediatamente los miARN exógenos administrados sistemáticamente imita in vivo, la entrega de miARN al riñón sigue siendo un desafío. Por lo tanto, son necesarios vectores que puedan proteger a los imitadores de miARN exógenos de la degradación por la ARNasa y entregarlos significativamente al riñón. Muchos estudios han utilizado vectores virales para administrar imitadores o inhibidores exógenos de miARN al riñón. Sin embargo, los vectores virales pueden causar una respuesta de interferón y/o inestabilidad genética. Por lo tanto, el desarrollo de vectores virales también es un obstáculo para el uso clínico de imitadores o inhibidores exógenos de miARN. Para superar estas preocupaciones con respecto a los vectores virales, desarrollamos un método de vector no viral para administrar imitadores de miARN al riñón utilizando la inyección en la vena de la cola de nanopartículas de polietilenimina (PEI-NP), lo que condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en varios modelos de ratón de enfermedad renal.
Introduction
Los miRNAs, pequeños ARN no codificantes (21-25 bases) que no se traducen en proteínas, inhiben muchos ARN mensajeros diana (ARNm) desestabilizándolos e inhibiendo su traducción en diversas enfermedades renales 1,2. Por lo tanto, la terapia génica que emplea imitadores o inhibidores exógenos de miARN sintetizados artificialmente es una nueva opción potencial para inhibir el desarrollo de muchas enfermedades renales 3,4,5.
A pesar de la promesa de imitadores o inhibidores de miARN para la terapia génica, la administración a órganos diana sigue siendo un gran obstáculo para que los experimentos in vivo desarrollen su potencial clínico. Debido a que los imitadores o inhibidores de miARN sintetizados artificialmente están sujetos a degradación inmediata por la RNasa sérica, su vida media se acorta con la administración sistémica in vivo6. Además, la eficiencia de los imitadores o inhibidores de miARN para atravesar la membrana plasmática y el citoplasma transfecto es generalmente mucho menor sin vectores apropiados 7,8. Estas líneas de evidencia sugieren que se requiere el desarrollo del sistema de administración de miRNA imitadores o inhibidores para el riñón, para permitir su uso en entornos clínicos y convertirlos en una nueva opción de tratamiento para pacientes con diversas enfermedades renales.
Los vectores virales se han utilizado como portadores para administrar imitadores o inhibidores exógenos de miARN al riñón 9,10. A pesar de haber sido desarrollados para la bioseguridad y la eficacia de la transfección, los vectores virales aún pueden causar una respuesta de interferón y/o inestabilidad genética11,12. Para superar estas preocupaciones, desarrollamos un sistema de administración de miRNA imita el riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), un vector no viral, en varios modelos de ratón de enfermedad renal13,14,15.
Los PEI-NP son NP lineales basados en polímeros que pueden entregar oligonucleótidos de manera efectiva, incluidos los imitadores de miARN, al riñón, y se consideran preferibles para preparar vectores no virales debido a su seguridad y biocompatibilidad a largo plazo13,16,17.
Este estudio demuestra los efectos de la administración sistemática de miARN exógeno con PEI-NP a través de la inyección de venas de cola en ratones modelo de fibrosis renal producidos por obstrucción unilateral del uréter (UUO). Además, demostramos los efectos de la administración sistemática de miRNA exógeno con PEI-NPs a través de la inyección de venas de la cola en ratones modelo de enfermedad renal diabética (ratones db / db: C57BLKS / J Iar -+Lepr db / +Leprdb) y ratones modelo de lesión renal aguda producidos por lesión renal por isquemia-reperfusión (IRI).
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando el protocolo presentado en este manuscrito, los PEI-NP pueden administrar imitadores de miARN al riñón para inducir la sobreexpresión de miARN objetivo, lo que resulta en efectos del tratamiento en modelos de ratón in vivo de varias enfermedades renales, incluida la fibrosis renal, la enfermedad renal diabética y la LRA.
El método para preparar el complejo de PEI-NPs y miRNA imitan es muy simple. La superficie cargada positivamente de los PEI-NPs atrapa la imitación de m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue parcialmente apoyado por JSPS KAKENHI (Subvención No. 21K08233). Agradecemos a Edanz (https://jp.edanz.com/ac) por editar los borradores de este manuscrito.
Materials
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
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