Em Ovo Injeção intravascular em embriões de frango

Summary

O objetivo geral deste artigo é descrever como se apresentar na injeção intracelular ovo de materiais exógenos em embriões de frango. Essa abordagem é muito útil para estudar a biologia do desenvolvimento de embriões de frango.

Abstract

Como um sistema modelo clássico de biologia de embriões, o embrião de frango tem sido usado para investigar o desenvolvimento e diferenciação embrionária. A entrega de materiais exógenos em embriões de frango tem uma grande vantagem para estudar a função genética, a reprodução transgênica e a preparação da quimera durante o desenvolvimento embrionário. Aqui mostramos o método de injeção intravascular ovo em que materiais exógenos, como vetores plasmídeos ou células germinativas primordiais modificadas (PGCs) podem ser transferidos para embriões de frango doadores em estágios iniciais de desenvolvimento. Os resultados mostram que a injeção intravascular através da aorta dorsal e da cabeça permite que materiais injetados se difundam em todo o embrião através do sistema circulatório sanguíneo. No protocolo apresentado, a eficácia da introdução do vetor plasmídeo exógeno e lentiviral, e a colonização de PGCs exógenos injetados na gônada receptora, foram determinadas pela observação da fluorescência nos embriões. Este artigo descreve procedimentos detalhados deste método, fornecendo assim uma excelente abordagem para estudar a função genética, embrião e biologia do desenvolvimento, e a produção de frango gônd-quimérico. Em conclusão, este artigo permitirá que os pesquisadores realizem na injeção intravascular de ovo de materiais exógenos em embriões de frango com grande sucesso e reprodutibilidade.

Introduction

Os embriões de frango têm sido amplamente utilizados por séculos em aplicações biológicas, de desenvolvimento, imunológicos, patológicos e outras^aplicações biológicas ^1,2,3. Eles têm muitas vantagens inerentes a outros modelos animais no estudo da toxicologia e biologia celular⁴. Os embriões de frango são facilmente acessíveis e podem ser manipulados in vitro e diretamente observados em qualquer estágio de desenvolvimento, o que fornece um sistema de modelo de pesquisa de embriões útil.

Em geral, os métodos atuais de entrega de embriões de frango, como eletrotransfesão e injeção subgerminal-cavidade, têm limitações como a exigência de equipamentos especializados e um programa projetado, e ineficiência devido à presença de gema e albumina ^5,6,7. Aqui mostramos um método de manuseio simples e eficiente para entregar materiais exógenos em embriões de frango. Esta pode ser uma ferramenta poderosa usada no estudo da biologia do desenvolvimento. Os materiais injetados se espalharam para todo o embrião através da circulação sanguínea. Durante o desenvolvimento precoce de embriões de frango, os PGCs poderiam migrar através do sangue, colonizar a crista genital e, em seguida, desenvolver-se em gametas, que fornecem um caminho valioso possível para entregar materiais exógenos⁸. Agora, este método tem sido amplamente utilizado no estudo da função genética, embrião e biologia do desenvolvimento, e a produção quimrica e transgênica de frango ^9,10,11.

Em ovo a injeção intravascular em embriões de frango é um método bem estabelecido e comumente utilizado 12,13,14. Neste artigo, mostramos uma descrição abrangente deste protocolo, incluindo materiais de injeção, locais, dosagem e resultados representativos.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo o cuidado e o uso de animais conformes às diretrizes do Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH Pub. nº 85-23, revisado em 1996) e os protocolos de embrião de frango foram aprovados pelo Comitê de Manejo Animal laboratorial e experimental animal da Universidade de Yangzhou, China (No.201803124). 1. Coleta e preparação de óvulos fertilizados NOTA: Ao contrário dos mamíferos, a galinha tem milhões de folícu…

Representative Results

Mostramos aqui a injeção intravascular in ovo de embriões de frango. Um processo esquemático da injeção intravascular é mostrado na Figura 1; em nosso estudo, usamos várias soluções exógenas para testar e verificar a injeção. Para melhor visualizar os materiais injetados, o Trypan Blue (0,4%) foi injetado como um rastreador no embrião. O rastreador (azul) foi observado para difundir todo o embrião através da circulação sanguíne…

Discussion

O método de injeção intravascular de embriões de frango é otimizado para que materiais exógenos (vetor, viral ou PGCs) sejam transferidos para o embrião. Com base neste método, construímos modelos de embrião de frango com superexpressão ou interferência genética estável (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Esses modelos bem estabelecidos comprovam a viabilidade dessa abordagem. Além disso, não apenas tra…

Materials

Fluorescence macro-microscope	OLYMPUS	MVX10
Glass Capillaries	Narishige	G1
Lipofectamine 2000	Invitrogen	12566014	liposome
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH26GL
pLVX-EGFP lentivirus vector	Addgene	128652
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
Puller	Narishige	PC-100
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061