Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon
Summary
Bu makalenin genel amacı, tavuk embriyolarına eksojen materyallerin hücre içi enjeksiyonunda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamaktır. Bu yaklaşım, tavuk embriyolarının gelişimsel biyolojisini incelemek için çok yararlıdır.
Abstract
Embriyo biyolojisinin klasik bir model sistemi olarak, tavuk embriyosu embriyonik gelişimi ve farklılaşmayı araştırmak için kullanılmıştır. Eksojen materyallerin tavuk embriyolarına verilmesi, embriyonik gelişim sırasında gen fonksiyonunu, transgenik ıslahı ve kimera preparatını incelemek için büyük bir avantaja sahiptir. Burada, plazmid vektörleri veya modifiye primordial germ hücreleri (PGC’ler) gibi eksojen materyallerin erken gelişim evrelerinde donör tavuk embriyolarına aktarılabildiği in ovo intravasküler enjeksiyon yöntemini gösteriyoruz. Sonuçlar, dorsal aort ve kafa yoluyla intravasküler enjeksiyonun, enjekte edilen materyallerin kan dolaşım sistemi yoluyla tüm embriyoya yayılmasına izin verdiğini göstermektedir. Sunulan protokolde, eksojen plazmid ve lentiviral vektör girişinin etkinliği ve alıcı gonadda enjekte edilen eksojen PGC’lerin kolonizasyonu, embriyolarda floresan gözlenerek belirlenmiştir. Bu makalede, bu yöntemin ayrıntılı prosedürleri açıklanmakta ve böylece gen fonksiyonu, embriyo ve gelişim biyolojisi ve gonad-kimerik tavuk üretimini incelemek için mükemmel bir yaklaşım sağlanmaktadır. Sonuç olarak, bu makale araştırmacıların tavuk embriyolarına eksojen materyallerin ovo intravasküler enjeksiyonunda büyük başarı ve tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirmelerini sağlayacaktır.
Introduction
Tavuk embriyoları gelişimsel, immünolojik, patolojik ve diğer biyolojik uygulamalarda yüzyıllardır yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3. Toksikoloji ve hücre biyolojisi çalışmalarında diğer hayvan modellerine göre birçok doğal avantaja sahiptirler4. Tavuk embriyolarına kolayca erişilebilir ve in vitro olarak manipüle edilebilir ve kullanışlı bir embriyo araştırma modeli sistemi sağlayan herhangi bir gelişim aşamasında doğrudan gözlemlenebilir.
Genel olarak, elektrotransfeksiyon ve subgerminal kavite enjeksiyonu gibi mevcut tavuk embriyosu verme yöntemleri, uzman ekipman ve tasarlanmış bir programın gerekliliği ve yumurta sarısı ve albümen 5,6,7’nin varlığından kaynaklanan verimsizlik gibi sınırlamalara sahiptir. Burada, eksojen materyalleri tavuk embriyolarına iletmek için basit ve etkili bir taşıma yöntemi gösteriyoruz. Bu, gelişim biyolojisi çalışmalarında kullanılan güçlü bir araç olabilir. Enjekte edilen materyaller kan dolaşımı yoluyla tüm embriyoya yayılır. Tavuk embriyolarının erken gelişimi sırasında, PGC’ler kan yoluyla göç edebilir, genital sırtı kolonize edebilir ve daha sonra eksojen materyalleri vermek için değerli bir olası yol sağlayan gametlere dönüşebilir8. Şimdi, bu yöntem gen fonksiyonu, embriyo ve gelişim biyolojisi ve kimerik ve transgenik tavuk üretimi 9,10,11 çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır.
In ovo tavuk embriyolarında intravasküler enjeksiyon köklü ve yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir12,13,14. Bu yazıda, enjeksiyon malzemeleri, bölgeler, dozaj ve temsili sonuçlar dahil olmak üzere bu protokolün kapsamlı bir tanımını göstereceğiz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tavuk embriyolarının in ovo intravasküler enjeksiyonu yöntemi, embriyoya aktarılacak eksojen materyaller (vektör, viral veya PGC’ler) için optimize edilmiştir. Bu yönteme dayanarak, kararlı gen aşırı ekspresyonu veya girişimi (SpinZ, JUN, UBE2I, vb.) 17,18,19. Bu köklü modeller bu yaklaşımın fizibilitesini kanıtlamaktadır. Ek olarak, izole PGC’leri sadece alıcının embriyo gonadına transfer etmek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31972547) tarafından desteklenmiştir. Jing Wang’ın metin editörlüğünü ve Malik Donlic’in Washington State Üniversitesi, ABD’deki seslendirmesini takdir ediyoruz.
Materials
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
