Quantitative Analyse der viskoelastischen Eigenschaften roter Blutkörperchen mittels optischer Pinzette und Defokussierungsmikroskopie
Summary
Hier wird ein integriertes Protokoll beschrieben, das auf einer optischen Pinzette und Defokussierungsmikroskopie basiert, um die rheologischen Eigenschaften von Zellen zu messen. Dieses Protokoll ist breit anwendbar bei der Untersuchung der viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten unter variablen physiopathologischen Bedingungen.
Abstract
Die viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten wurden mit einer Reihe von Techniken untersucht. Die berichteten experimentellen Daten variieren jedoch. Dies wird nicht nur auf die normale Variabilität der Zellen zurückgeführt, sondern auch auf die Unterschiede in den Methoden und Modellen der Zellantwort. Hier wird ein integriertes Protokoll mit optischer Pinzette und Defokussierungsmikroskopie verwendet, um die rheologischen Eigenschaften roter Blutkörperchen im Frequenzbereich von 1 Hz bis 35 Hz zu erhalten. Während optische Pinzetten verwendet werden, um die elastische Konstante des Erythrozytenkomplexes zu messen, ist die Defokussierungsmikroskopie in der Lage, das Zellhöhenprofil, das Volumen und den Formfaktor zu ermitteln, einen Parameter, der die Umwandlung der komplexen elastischen Konstante in einen komplexen Schermodul ermöglicht. Darüber hinaus kann durch Anwendung eines Weichglas-Rheologiemodells der Skalierungsexponent für beide Module erhalten werden. Die entwickelte Methodik ermöglicht es, das mechanische Verhalten roter Blutkörperchen zu untersuchen und ihre viskoelastischen Parameter zu charakterisieren, die unter genau definierten experimentellen Bedingungen für verschiedene physiologische und pathologische Bedingungen ermittelt wurden.
Introduction
Reife rote Blutkörperchen (RBCs), auch Erythrozyten genannt, sind in der Lage, sich mehr als doppelt so groß auszudehnen, wenn sie die engsten Kapillaren des menschlichen Körpers passieren1. Diese Fähigkeit wird auf ihre einzigartige Fähigkeit zurückgeführt, sich bei äußeren Belastungen zu verformen.
In den letzten Jahren haben verschiedene Studien dieses Merkmal in Erythrozytenoberflächencharakterisiert 2,3. Das Gebiet der Physik, das die elastischen und viskosen Reaktionen von Materialien aufgrund äußerer Belastungen beschreibt, wird als Rheologie bezeichnet. Wenn eine äußere Kraft ausgeübt wird, hängt die resultierende Verformung im Allgemeinen von den Eigenschaften des Materials ab und kann in elastische Verformungen, die Energie speichern, oder viskose Verformungen, die Energie abführen, unterteilt werden4. Alle Zellen, einschließlich der Erythrozyten, zeigen ein viskoelastisches Verhalten; Mit anderen Worten: Energie wird sowohl gespeichert als auch abgeführt. Die viskoelastische Reaktion einer Zelle kann somit durch ihren komplexen Schermodul G*(ω) = G’(ω) + iG“(ω) charakterisiert werden, wobei G’ (ω) der Speichermodul ist, bezogen auf das elastische Verhalten, und G” (ω) der Verlustmodul, bezogen auf ihre Viskosität4. Darüber hinaus wurden phänomenologische Modelle verwendet, um Zellantworten zu beschreiben, eines der am häufigsten verwendeten ist das weiche Glasrheologiemodell5, das durch eine Potenzgesetzabhängigkeit des komplexen Schermoduls mit der Lastfrequenz gekennzeichnet ist.
Einzelzellbasierte Methoden wurden verwendet, um die viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten zu charakterisieren, indem Kraft aufgebracht und die Verschiebung in Abhängigkeit von der Nutzlast gemessen wurde 2,3. Für den komplexen Schubmodul finden sich in der Literatur jedoch nur wenige Ergebnisse. Mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung wurden Werte für die Erythrozytenspeicherung und die Verlustmodule im Frequenzbereich von 1-100 Hz6 berichtet, die zwischen 0,01 und 1 Pa lagen. Mit Hilfe der optischen magnetischen Verdrillungszytometrie wurde ein scheinbarer komplexer Elastizitätsmodul7 erhalten, und zu Vergleichszwecken wurde ein multiplikativer Faktor beansprucht, um die Diskrepanzen möglicherweise zu klären.
In jüngerer Zeit wurde eine neue Methodik entwickelt, die auf einer optischen Pinzette (OT) zusammen mit der Defokussierungsmikroskopie (DM) als integriertes Werkzeug zur quantitativen Kartierung der Speicherung und des Verlusts von Schermodulen menschlicher Erythrozyten über zeitabhängige Belastungen basiert 8,9. Darüber hinaus wurde ein weiches, glasartiges Rheologiemodell verwendet, um die Ergebnisse anzupassen und einen Potenzgesetzkoeffizienten zu erhalten, der die Erythrozyten charakterisiert 8,9.
Insgesamt klärt die entwickelte Methodik8,9, deren Protokoll im Folgenden ausführlich beschrieben wird, bisherige Diskrepanzen durch die Verwendung der Messwerte für den Formfaktor Ff, der Kräfte und Verformungen mit Spannungen und Dehnungen in der Erythrozytenoberfläche in Beziehung setzt und als neuartiges diagnostisches Verfahren verwendet werden kann, das in der Lage ist, die viskoelastischen Parameter und weichglasigen Merkmale von Erythrozyten quantitativ zu bestimmen, die von Personen mit unterschiedlichem Blut erhalten wurden Pathologien. Eine solche Charakterisierung unter Verwendung des unten beschriebenen Protokolls könnte neue Möglichkeiten eröffnen, das Verhalten von Erythrozyten aus mechanobiologischer Sicht zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll wird eine integrierte Methode vorgestellt, die auf einer optischen Pinzette und Defokussierungsmikroskopie basiert, um die viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten quantitativ abzubilden. Die Ergebnisse für die Speicher- und Verlustschermodule sowie der Skalierungsexponent, der die weiche Glasrheologie von Erythrozyten charakterisiert, werden bestimmt. Die Anwendung dieses Protokolls für verschiedene experimentelle Bedingungen, wie z.B. in physiologischer Situation8 od…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei allen Mitgliedern der CENABIO Advanced Microscopy Facility für ihre wichtige Hilfe. Diese Arbeit wurde von den brasilianischen Agenturen Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) und Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) zusammen mit der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) unterstützt. B.P. wurde durch ein JCNE-Stipendium von FAPERJ unterstützt.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
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