광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 사용한 적혈구의 점탄성 특성에 대한 정량적 분석
Summary
여기에서는 세포의 유변학적 특성을 측정하기 위해 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 생리병리학적 조건에서 적혈구의 점탄성 특성을 연구하는 데 광범위하게 적용할 수 있습니다.
Abstract
적혈구의 점탄성 특성은 다양한 기술에 의해 조사되었습니다. 그러나 보고된 실험 데이터는 다양합니다. 이것은 세포의 정상적인 가변성뿐만 아니라 세포 반응의 방법과 모델의 차이에 기인합니다. 여기서, 광학 핀셋 및 디포커싱 현미경을 사용하는 통합 프로토콜은 1 Hz 내지 35 Hz의 주파수 범위에서 적혈구의 유변학적 특징을 얻기 위해 사용된다. 광학 핀셋은 적혈구 복합 탄성 상수를 측정하는 데 사용되지만, 디포커싱 현미경은 복잡한 탄성 상수를 복잡한 전단 계수로 변환할 수 있는 매개변수인 세포 높이 프로파일, 부피 및 폼 팩터를 얻을 수 있습니다. 또한, 부드러운 유리질 유변학 모델을 적용하면 두 모듈리에 대한 스케일링 지수를 얻을 수 있습니다. 개발 된 방법론은 적혈구의 기계적 거동을 탐구하여 여러 생리 학적 및 병리학 적 조건에 대해 잘 정의 된 실험 조건에서 얻은 점탄성 매개 변수를 특성화 할 수 있습니다.
Introduction
적혈구라고도 알려진 성숙한 적혈구(RBC)는 인체의 가장 좁은 모세혈관을 통과할 때 크기가 두 배 이상 확장될 수 있습니다1. 이러한 용량은 외부 하중을 받을 때 변형되는 고유한 능력에 기인합니다.
최근 몇 년 동안, 다른 연구들은 적혈구 표면 2,3에서 이 특징을 특징지었다. 외부 하중으로 인한 재료의 탄성 및 점성 반응을 설명하는 물리학 영역을 유변학이라고합니다. 일반적으로 외력이 가해지면 재료의 특성에 따라 변형이 발생하며, 에너지를 저장하는 탄성 변형 또는 에너지를 소산하는 점성 변형으로 나눌 수 있다4. 적혈구를 포함한 모든 세포는 점탄성 거동을 나타냅니다. 즉, 에너지는 저장되고 소산됩니다. 따라서 전지의 점탄성 반응은 복소 전단 계수 G*(ω) = G'(ω) + iG“(ω)로 특성화될 수 있으며, 여기서 G‘(ω)는 탄성 거동과 관련된 저장 탄성률이고, G”(ω)는 점도와 관련된 손실 계수이다4. 더욱이, 현상학적 모델은 세포 반응을 기술하기 위해 사용되어 왔으며, 가장 많이 사용되는 것 중 하나는 하중 주파수에 따른 복잡한 전단 계수의 멱법칙 의존성을 특징으로 하는 연질 유리질 유변학 모델5라고 합니다.
단일 셀 기반 방법은 힘을 가하고 부과 된 하중 2,3의 함수로 변위를 측정함으로써 적혈구의 점탄성 특성을 특성화하는 데 사용되었습니다. 그러나, 복잡한 전단 계수의 경우, 문헌에서 거의 결과를 찾을 수 없다. 동적 광 산란을 사용하여 RBC 저장 및 손실 계수 값은 1-100Hz6의 주파수 범위에서 0.01-1Pa로 변하는 것으로 보고되었습니다. 광학 자기 비틀림 세포분석법을 사용하여 겉보기 복합 탄성률(complex elastic modulus)을 얻었으며7, 비교 목적으로, 불일치를 명확히 하기 위해 곱셈 계수(multiplicative factor)를 주장했다.
보다 최근에, 시간 의존적 하중에 대한 인간 적혈구의 전단 계수의 저장 및 손실을 정량적으로 매핑하는 통합 도구로서 광학 핀셋(OT)과 디포커싱 현미경(DM)을 기반으로 하는 새로운 방법론이 확립되었습니다 8,9. 또한, 부드러운 유리질 유변학 모델을 사용하여 결과를 피팅하고 RBC 8,9를 특징짓는 멱법칙 계수를 얻었습니다.
전반적으로, 개발된 방법론(8,9)에 대한 프로토콜은 아래에 상세히 기술되어 있으며, RBC 표면의 응력 및 변형에 대한 힘 및 변형을 관련시키는 폼 팩터 Ff에 대한 측정값을 사용하여 이전의 불일치를 명확히 하고, 상이한 혈액을 가진 개인으로부터 얻어진 적혈구의 점탄성 파라미터 및 연질 유리질 특징을 정량적으로 결정할 수 있는 새로운 진단 방법으로서 활용될 수 있다 병리학. 아래에 설명된 프로토콜을 사용하는 이러한 특성화는 기계생물학적 관점에서 적혈구의 거동을 이해할 수 있는 새로운 가능성을 열 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 방법을 제시하여 RBC의 점탄성 특성을 정량적으로 매핑합니다. 저장 및 손실 전단 계수에 대한 결과와 RBC의 연질 유리 유변학을 특징짓는 스케일링 지수가 결정됩니다. 생리학적 상황8 또는 P. falciparum intra-erythrocyticcycle9 의 각 단계와 같은 다양한 실험 조건에 대한 이 프로토콜의 적?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 가장 중요한 도움을 주신 CENABIO 고급 현미경 시설의 모든 구성원에게 감사를 표합니다. 이 작업은 브라질 기관인 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) 및 Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx)와 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)의 지원을 받았습니다. BP는 FAPERJ의 JCNE 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
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