Análise quantitativa das propriedades viscoelásticas das hemácias utilizando pinças ópticas e microscopia desfocagem
Summary
Aqui, um protocolo integrado baseado em pinças ópticas e microscopia de desfocagem é descrito para medir as propriedades reológicas das células. Este protocolo tem ampla aplicabilidade no estudo das propriedades viscoelásticas de eritrócitos sob condições fisiopatológicas variáveis.
Abstract
As propriedades viscoelásticas dos eritrócitos têm sido investigadas por uma variedade de técnicas. No entanto, os dados experimentais relatados variam. Isso não é atribuído apenas à variabilidade normal das células, mas também às diferenças nos métodos e modelos de resposta celular. Aqui, um protocolo integrado utilizando pinças ópticas e microscopia desfocagem é empregado para obter as características reológicas das hemácias na faixa de frequência de 1 Hz a 35 Hz. Enquanto pinças ópticas são utilizadas para medir a constante elástica complexo eritrocito, a microscopia de desfocalização é capaz de obter o perfil de altura celular, volume e seu fator de forma um parâmetro que permite a conversão de constante elástica complexa em módulo de cisalhamento complexo. Além disso, aplicando um modelo de reologia vítrea macia, o expoente de escala para ambos os módulos pode ser obtido. A metodologia desenvolvida permite explorar o comportamento mecânico das hemácias, caracterizando seus parâmetros viscoelásticos, obtidos em condições experimentais bem definidas, para diversas condições fisiológicas e patológicas.
Introduction
As hemácias maduras, também conhecidas como eritrócitos, são capazes de se estender por mais que o dobro de seu tamanho ao passar pelos capilares mais estreitos do corpo humano1. Tal capacidade é atribuída à sua capacidade única de deformar quando submetidos a cargas externas.
Nos últimos anos, diferentes estudos têm caracterizado essa característica na superfície das hemácias2,3. A área da física que descreve as respostas elásticas e viscosas dos materiais devido a cargas externas é chamada de reologia. Em geral, quando uma força externa é aplicada, a deformação resultante depende das propriedades do material e pode ser dividida em deformações elásticas, que armazenam energia, ou deformações viscosas, que dissipam energia4. Todas as células, incluindo as hemácias, exibem um comportamento viscoelástico; Em outras palavras, a energia é armazenada e dissipada. A resposta viscoelástica de uma célula pode, assim, ser caracterizada pelo seu módulo de cisalhamento complexo G*(ω) = G'(ω) + iG“(ω), onde G‘ (ω) é o módulo de armazenamento, relacionado ao comportamento elástico, e G” (ω) é o módulo de perda, relacionado à sua viscosidade4. Além disso, modelos fenomenológicos têm sido utilizados para descrever as respostas celulares, um dos mais utilizados é o chamado modelo de reologia vítreamole5, caracterizado por uma dependência da lei de potência do módulo de cisalhamento complexo com a frequência de carga.
Métodos unicelulares têm sido empregados para caracterizar as propriedades viscoelásticas das hemácias, aplicando força e medindo o deslocamento em função da carga imposta 2,3. Entretanto, para o módulo de cisalhamento complexo, poucos resultados podem ser encontrados na literatura. Usando espalhamento dinâmico de luz, foram relatados valores de armazenamento e perda de hemácias variando de 0,01-1 Pa, na faixa de frequência de 1-100 Hz6. Utilizando-se a citometria de torção magnética óptica, obteve-se módulo elástico complexo aparente7 e, para fins de comparação, um fator multiplicativo foi reivindicado para possivelmente esclarecer as discrepâncias.
Mais recentemente, uma nova metodologia baseada em pinças ópticas (OT) em conjunto com a microscopia de desfocalização (DM), como uma ferramenta integrada para mapear quantitativamente o armazenamento e a perda de módulos de cisalhamento de eritrócitos humanos ao longo de cargas tempo-dependentes, foi estabelecida 8,9. Além disso, um modelo de reologia vítrea mole foi utilizado para ajustar os resultados e obter um coeficiente de lei de potência que caracteriza as hemácias 8,9.
De modo geral, a metodologia desenvolvida8,9, cujo protocolo é descrito em detalhes a seguir, esclarece discrepâncias prévias ao utilizar os valores medidos para o fator de forma, Ff, que relaciona forças e deformações a tensões e deformações na superfície das hemácias e pode ser utilizado como um novo método diagnóstico capaz de determinar quantitativamente os parâmetros viscoelásticos e as características vítreas moles de hemácias obtidas de indivíduos com sangue diferente Patologias. Tal caracterização, utilizando o protocolo descrito a seguir, pode abrir novas possibilidades para a compreensão do comportamento das hemácias do ponto de vista mecanobiológico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, um método integrado baseado em pinças ópticas e microscopia de desfocagem é apresentado para mapear quantitativamente as propriedades viscoelásticas das hemácias. Os resultados para os módulos de cisalhamento de armazenamento e perda, juntamente com o expoente de escala que caracteriza a reologia vítrea mole das hemácias são determinados. A aplicação deste protocolo para diferentes condições experimentais, como na situação fisiológica8 ou ao longo de cada estágio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a todos os membros da instalação de microscopia avançada do CENABIO pela ajuda importante. Este trabalho contou com o apoio das agências brasileiras Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Código Financeiro 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) em conjunto com a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. foi apoiado por uma bolsa JCNE da FAPERJ.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. . Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
