ניתוח כמותי של תכונות ויסקו-אלסטיות של תאי דם אדומים באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus
Summary
כאן, פרוטוקול משולב המבוסס על פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus מתואר כדי למדוד את התכונות הריאולוגיות של תאים. פרוטוקול זה יש ישימות רחבה בחקר התכונות viscoelastic של אריתרוציטים בתנאים פיזיולוגיים-פתולוגיים משתנים.
Abstract
התכונות viscoelastic של אריתרוציטים נחקרו על ידי מגוון של טכניקות. עם זאת, נתוני הניסוי המדווחים משתנים. זה לא מיוחס רק לשונות הרגילה של תאים, אלא גם להבדלים בשיטות ובמודלים של תגובת התא. כאן, פרוטוקול משולב באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus משמש כדי לקבל את התכונות הריאולוגיות של תאי דם אדומים בטווח התדרים של 1 הרץ עד 35 הרץ. בעוד פינצטה אופטית משמשת למדידת הקבוע האלסטי המורכב על ידי אריתרוציטים, מיקרוסקופ defocus מסוגל לקבל את פרופיל גובה התא, נפחו וגורם הצורה שלו פרמטר המאפשר המרה של קבוע אלסטי מורכב למודולוס גזירה מורכב. יתר על כן, יישום מודל ריאולוגיה זכוכית רכה, מעריך קנה המידה עבור שני מודולי ניתן להשיג. המתודולוגיה שפותחה מאפשרת לחקור את ההתנהגות המכנית של תאי הדם האדומים, המאפיינת את הפרמטרים הוויסקו-אלסטיים שלהם, המתקבלים בתנאי ניסוי מוגדרים היטב, עבור מספר תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
Introduction
תאי דם אדומים בוגרים (RBCs), הידועים גם בשם אריתרוציטים, מסוגלים להרחיב יותר מפי שניים מגודלם כאשר עוברים דרך הנימים הצרים ביותר של גוף האדם1. יכולת זו מיוחסת ליכולתם הייחודית להתעוות כאשר הם נתונים לעומסים חיצוניים.
בשנים האחרונות, מחקרים שונים אפיינו תכונה זו במשטחי RBC 2,3. תחום הפיזיקה המתאר את התגובות האלסטיות והצמיגיות של חומרים עקב עומסים חיצוניים נקרא ריאולוגיה. באופן כללי, כאשר מופעל כוח חיצוני, העיוות המתקבל תלוי בתכונות החומר וניתן לחלק אותו לעיוותים אלסטיים, האוגרים אנרגיה, או עיוותים צמיגיים, המפזרים אנרגיה4. כל התאים, כולל RBCs, מפגינים התנהגות ויסקו-אלסטית; במילים אחרות, האנרגיה נאגרת ומתפזרת. התגובה הוויסקו-אלסטית של התא יכולה אפוא להיות מאופיינת על ידי מודולוס הגזירה המורכב שלו G*(ω) = G'(ω) + iG“(ω), כאשר G’ (ω) הוא מודולוס האחסון, הקשור להתנהגות האלסטית, ו-G” (ω) הוא מודולוס ההפסד, הקשור לצמיגותו4. יתר על כן, מודלים פנומנולוגיים שימשו לתיאור תגובות התא, אחד הנפוצים ביותר נקרא מודל ריאולוגיה זכוכית רכה5, המאופיין בתלות חוק כוח של מודולוס הגזירה המורכב עם תדירות העומס.
שיטות מבוססות תא בודד שימשו כדי לאפיין את התכונות הוויסקו-אלסטיות של RBCs, על ידי הפעלת כוח ומדידת תזוזה כפונקציה של העומס המוטל 2,3. עם זאת, עבור מודולוס הגזירה המורכב, ניתן למצוא תוצאות מעטות בספרות. באמצעות פיזור אור דינמי, דווח על ערכים עבור מודולי אחסון ואובדן RBC הנעים בין 0.01-1 Pa, בתחום התדרים של 1-100 הרץ6. על ידי שימוש בציטומטריה אופטית מעוותת מגנטית, התקבל מודולוס אלסטי מורכב לכאורה7, ולצורך השוואה נטען כי גורם כפל עשוי להבהיר את אי ההתאמות.
לאחרונה, מתודולוגיה חדשה המבוססת על פינצטה אופטית (OT) יחד עם מיקרוסקופ defocus (DM), ככלי משולב למיפוי כמותי של אחסון ואובדן מודולי גזירה של אריתרוציטים אנושיים על עומסים תלויי זמן, הוקמה 8,9. בנוסף, נעשה שימוש במודל ריאולוגיה רכה וזגוגית כדי להתאים את התוצאות ולקבל מקדם חוק כוח המאפיין את RBCs 8,9.
בסך הכל, המתודולוגיה המפותחת8,9, שהפרוטוקול עבורה מתואר בפירוט להלן, מבהירה אי-התאמות קודמות באמצעות הערכים הנמדדים עבור גורם הצורה, Ff, המקשר כוחות ועיוותים ללחצים ומתחים בפני השטח של RBC וניתן להשתמש בו כשיטת אבחון חדשנית המסוגלת לקבוע כמותית את הפרמטרים הוויסקו-אלסטיים ואת תכונות הזכוכית הרכה של RBCs המתקבלים מאנשים עם דם שונה פתולוגיות. אפיון כזה, תוך שימוש בפרוטוקול המתואר להלן, עשוי לפתוח אפשרויות חדשות להבנת התנהגותם של RBCs מנקודת מבט מכנוביולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, מוצגת שיטה משולבת המבוססת על פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus כדי למפות כמותית את התכונות הויסקו-אלסטיות של RBCs. נקבעות תוצאות עבור מודולי הגזירה של אחסון ואובדן, יחד עם מעריך קנה המידה המאפיין את הריאולוגיה הזגוגית הרכה של RBC. יישום פרוטוקול זה עבור תנאי ניסוי שונים, כגון במצב פי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לכל חברי מתקן המיקרוסקופיה המתקדם CENABIO על העזרה החשובה ביותר. עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנויות הברזילאיות Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), ו- Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) יחד עם Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. נתמכה על ידי מענק JCNE מ-FAPERJ.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. . Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
