زراعة خلايا IDG-SW3 في مصفوفة ثلاثية الأبعاد خارج الخلية
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لزراعة خلايا IDG-SW3 في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الخلية.
Abstract
تعتبر الخلايا العظمية خلايا غير تكاثرية متمايزة بشكل نهائي عن بانيات العظم. تعبر بانيات العظم المضمنة في المصفوفة العظمية خارج الخلية (العظمية) عن جين Pdpn لتكوين الزوائد الشجيرية الخلوية والتحول إلى خلايا ما قبل العظم. في وقت لاحق ، تعبر الخلايا العظمية السابقة عن جين Dmp1 لتعزيز تمعدن المصفوفة وبالتالي تتحول إلى خلايا عظمية ناضجة. وتسمى هذه العملية تكوين الخلايا العظمية. IDG-SW3 هو خط خلايا معروف للدراسات في المختبر لتكوين الخلايا العظمية. استخدمت العديد من الطرق السابقة الكولاجين I باعتباره المكون الرئيسي أو الوحيد لمصفوفة الاستزراع. ومع ذلك ، بالإضافة إلى الكولاجين الأول ، يحتوي العظم العظمي أيضا على مادة أرضية ، وهي عنصر مهم في تعزيز نمو الخلايا والالتصاق والهجرة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مادة المصفوفة شفافة ، مما يزيد من شفافية هلام الكولاجين I ، وبالتالي يساعد في استكشاف تكوين التغصنات من خلال تقنيات التصوير. وبالتالي ، فإن هذه الورقة تفصل بروتوكولا لإنشاء هلام ثلاثي الأبعاد باستخدام مصفوفة خارج الخلية جنبا إلى جنب مع الكولاجين I لبقاء IDG-SW3. في هذا العمل ، تم تحليل تكوين التغصنات والتعبير الجيني أثناء تكوين الخلايا العظمية. بعد 7 أيام من الثقافة العظمية ، لوحظت شبكة تغصنات واسعة النطاق بوضوح تحت مجهر متحد البؤر مضان. أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أن مستويات mRNA من Pdpn و Dmp1 زادت باستمرار لمدة 3 أسابيع. في الأسبوع 4 ، كشف المجهر المجسم عن هلام معتم مليء بالجزيئات المعدنية ، بما يتفق مع مقايسة مضان الأشعة السينية (XRF). تشير هذه النتائج إلى أن مصفوفة الثقافة هذه تسهل بنجاح الانتقال من بانيات العظم إلى الخلايا العظمية الناضجة.
Introduction
الخلايا العظمية هي خلايا متمايزة بشكل نهائي مشتقة من بانيات العظم 1,2. بمجرد دفن بانيات العظم بواسطة العظم العظمي ، فإنه يخضع لتكوين الخلايا العظمية ويعبر عن جين Pdpn لتشكيل الخلايا العظمية ، وجين Dmp1لتمعدن العظم ، وجينات Sost و Fgf23 لتعمل كخلية عظمية ناضجة في أنسجة العظام3. هنا ، يتم تقديم نظام زراعة 3D لتحديد امتداد التغصنات والتعبير الجيني علامة في عملية تكوين الخلايا العظمية.
خلايا IDG-SW3 هي خط خلايا أولي خالد مشتق من الفئران المعدلة وراثيا ويمكنها توسيع أو تكرار بانيات العظم إلى تمايز الخلايا العظمية المتأخرة عند زراعتها في وسائط مختلفة4. بالمقارنة مع MLO-A5 و MLO-Y4 وخطوط الخلايا الأخرى ، من المرجح أن يكون ملف تعريف التعبير للبروتينات الوظيفية ، والقدرة على أداء ترسب ملح الكالسيوم ، والاستجابات للهرمونات المختلفة في خلايا IDG-SW3 هي نفسها تلك الموجودة في الخلايا العظمية الأولية في الأنسجة العظمية4.
بالمقارنة مع أنظمة 2D ، فإن أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد أكثر قدرة على محاكاة بيئة النمو الخلوي في الجسم الحي ، بما في ذلك تدرج المغذيات ، والصلابة الميكانيكية المنخفضة ، والنطاق الميكانيكي المحيط (الجدول 1). استخدمت معظم الطرق السابقة لزراعة الخلايا العظمية في نظام ثلاثي الأبعاد الكولاجين I كمكون فريد في التركيبات4،5،6 ، لأن ألياف الكولاجين I تعمل كموقع لترسب الكالسيوم والفوسفور. ومع ذلك ، فإن المكون الذي لا غنى عنه في العظم ، المصفوفة خارج الخلية ، يحتوي على مجموعة كبيرة من العوامل الخلوية التي تعزز النمو الخلوي والالتصاق والهجرة 7,8 وهو شفاف ومناسب لمراقبة التصوير. وبالتالي ، يستخدم هذا البروتوكول Matrigel (المشار إليه فيما يلي باسم مصفوفة الغشاء القاعدي) كمكون ثانوي لدراسة تكوين الخلايا العظمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
النقطة الحرجة في هذا البروتوكول هي أنه يجب تنفيذ الخطوتين 1 و 2 على الجليد لمنع التخثر التلقائي. في هذه الطريقة ، كان التركيز النهائي للكولاجين I 1.2 مجم / مل. وبالتالي ، يجب حساب حجم ddH2O الأمثل لمطابقة الكولاجين المختلفة من مختلف الشركات المصنعة.
في الجسم الحي ، ينطوي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة ليندا ف. بونوالد على إهداء خط خلايا IDG-SW3. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82070902 و 82100935 و 81700778) ومشروع شنغهاي للإبحار “ابتكار العلوم والتكنولوجيا” (21YF1442000).
Materials
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell … and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
- Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
- Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
- Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
- Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
- Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
- Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).
