IDG-SW3 Zellkultur in einer dreidimensionalen extrazellulären Matrix

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Kultivierung von IDG-SW3-Zellen in einer dreidimensionalen (3D) extrazellulären Matrix vor.

Abstract

Osteozyten gelten als nicht-proliferative Zellen, die sich terminalmäßig von Osteoblasten unterscheiden. Osteoblasten, die in die extrazelluläre Matrix des Knochens (Osteoid) eingebettet sind, exprimieren das Pdpn-Gen , um zelluläre Dendriten zu bilden und sich in Präosteozyten umzuwandeln. Später exprimieren Präosteozyten das Dmp1-Gen , um die Matrixmineralisierung zu fördern und sich dadurch in reife Osteozyten umzuwandeln. Dieser Prozess wird als Osteozytogenese bezeichnet. IDG-SW3 ist eine bekannte Zelllinie für In-vitro-Studien zur Osteozytogenese. Viele frühere Methoden haben Kollagen I als Haupt- oder einzige Komponente der Kultivierungsmatrix verwendet. Neben Kollagen I enthält das Osteoid jedoch auch eine Grundsubstanz, die eine wichtige Komponente bei der Förderung des Zellwachstums, der Adhäsion und der Migration ist. Darüber hinaus ist die Matrixsubstanz transparent, was die Transparenz des Kollagen-I-gebildeten Gels erhöht und somit die Erforschung der Dendritenbildung durch bildgebende Verfahren unterstützt. Daher wird in dieser Arbeit ein Protokoll zur Etablierung eines 3D-Gels unter Verwendung einer extrazellulären Matrix zusammen mit Kollagen I für das Überleben von IDG-SW3 beschrieben. In dieser Arbeit wurden die Dendritenbildung und die Genexpression während der Osteozytogenese untersucht. Nach 7 Tagen osteogener Kultur konnte unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop deutlich ein ausgedehntes Dendritennetzwerk beobachtet werden. Die Real-Time-PCR zeigte, dass die mRNA-Spiegel von Pdpn und Dmp1 über 3 Wochen kontinuierlich anstiegen. In Woche 4 zeigte das Stereomikroskop ein undurchsichtiges Gel, das mit Mineralpartikeln gefüllt war, was mit dem Röntgenfluoreszenz-Assay (RFA) übereinstimmte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Kulturmatrix den Übergang von Osteoblasten zu reifen Osteozyten erfolgreich erleichtert.

Introduction

Osteozyten sind terminale differenzierte Zellen, die von Osteoblasten abstammen ^1,2. Sobald der Osteoblast vom Osteoid begraben ist, durchläuft er eine Osteozytogenese und exprimiert das Pdpn-Gen, um Präosteozyten zu bilden, das Dmp1-Gen^{, um das Osteoid zu mineralisieren, und die} Sost– und Fgf23-Gene, um als reifer Osteozyt im Knochengewebe zu fungieren³. Hier wird ein 3D-Kultivierungssystem eingeführt, um die Dendritenverlängerung und die Markergenexpression im Osteozytogeneseprozess zu identifizieren.

IDG-SW3-Zellen sind eine immortalisierte primäre Zelllinie, die von transgenen Mäusen abstammt und die Differenzierung von Osteoblasten bis hin zu späten Osteozyten erweitern oder replizieren können, wenn sie in verschiedenen Medien kultiviert^{werden 4}. Im Vergleich zu MLO-A5, MLO-Y4 und anderen Zelllinien sind das Expressionsprofil funktioneller Proteine, die Fähigkeit, Kalziumsalzablagerungen durchzuführen, und die Reaktionen auf verschiedene Hormone in IDG-SW3-Zellen eher die gleichen wie die von primären Osteozyten im Knochengewebe⁴.

Im Vergleich zu 2D-Systemen sind 3D-Kultivierungssysteme besser in der Lage, die In-vivo-Zellwachstumsumgebung nachzuahmen, einschließlich des Nährstoffgradienten, der geringen mechanischen Steifigkeit und des umgebenden mechanischen Bereichs (Tabelle 1). Die meisten der bisherigen Methoden zur Kultivierung osteoblastischer Zellen in einem 3D-System verwendeten Kollagen I als einzigartige Komponente in Formulierungen ^4,5,6, da Kollagen-I-Fasern als Ort der Kalzium- und Phosphorablagerung dienen. Ein unverzichtbarer Bestandteil des Osteoids, die extrazelluläre Matrix, enthält jedoch eine große Gruppe zellulärer Faktoren, die das Zellwachstum, die Adhäsion und die Migration fördern ^7,8 und ist transparent und für die bildgebende Beobachtung geeignet. Daher verwendet dieses Protokoll Matrigel (im Folgenden als Basalmembranmatrix bezeichnet) als sekundäre Komponente für die Osteozytogenese-Studie.

Protocol

Dieses Protokoll eignet sich für die Kultivierung von Zellen in vier Wells mit 24-Well-Platten. Bei der Vorbereitung mehrerer Proben oder Platten sollten die Mengen der Reagenzien entsprechend erhöht werden. 1. Herstellung der Kollagen-I-Mischung HINWEIS: Kollagen I und Basalmembran-Matrix-Gel schnell bei Raumtemperatur. Daher sollte Kollagen auf Eis (2 °C bis 8 °C) gehandhabt werden. Alle verwendeten Spitzen und Röhrchen müssen vorgekühlt werd…

Representative Results

Nach der Färbung lebender/toter Zellen wurden die Zellen mit einem konfokalen Lasermikroskop sichtbar gemacht. Alle Zellen waren Calcein-AM-positiv (grüne Farbe), und es gab fast keine EthD-1-positiven Zellen (rote Farbe) im Feld, was darauf hindeutet, dass das mit dieser Methode hergestellte Gelsystem sehr gut für die Osteozytogenese geeignet ist (Abbildung 1A, links). Um die räumliche Verteilung der Zellen besser bestimmen zu können, wurde ein Pseudofarbenbild gewählt, um die Zellden…

Discussion

Ein kritischer Punkt in diesem Protokoll ist, dass die Schritte 1 und 2 auf Eis durchgeführt werden müssen, um eine spontane Gerinnung zu verhindern. Bei dieser Methode betrug die Endkonzentration von Kollagen I 1,2 mg/ml. Daher sollte ein optimales_{ddH2O-Volumen}berechnet werden, das zu den verschiedenen Kollagenen verschiedener Hersteller passt.

In vivo beinhaltet die Osteozytogenese eine polare Bewegung von Osteoblasten von der Oberfläche ins Innere des trabekulären Kn…

Materials

0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422