Culture cellulaire IDG-SW3 dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle

Summary

Nous présentons ici un protocole de culture de cellules IDG-SW3 dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle (3D).

Abstract

Les ostéocytes sont considérés comme des cellules non prolifératives qui se différencient de manière terminale des ostéoblastes. Les ostéoblastes intégrés dans la matrice extracellulaire osseuse (ostéoïde) expriment le gène Pdpn pour former des dendrites cellulaires et se transformer en préostéocytes. Plus tard, les préostéocytes expriment le gène Dmp1 pour favoriser la minéralisation de la matrice et ainsi se transformer en ostéocytes matures. Ce processus s’appelle l’ostéocytogenèse. IDG-SW3 est une lignée cellulaire bien connue pour les études in vitro de l’ostéocytogenèse. De nombreuses méthodes précédentes ont utilisé le collagène I comme composant principal ou unique de la matrice de culture. Cependant, en plus du collagène I, l’ostéoïde contient également une substance fondamentale, qui est un élément important pour favoriser la croissance, l’adhésion et la migration cellulaires. De plus, la substance matricielle est transparente, ce qui augmente la transparence du gel de collagène formé en I et, ainsi, facilite l’exploration de la formation de dendrites grâce à des techniques d’imagerie. Ainsi, cet article détaille un protocole pour établir un gel 3D utilisant une matrice extracellulaire avec du collagène I pour la survie d’IDG-SW3. Dans ce travail, la formation des dendrites et l’expression des gènes ont été analysées au cours de l’ostéocytogenèse. Après 7 jours de culture ostéogénique, un vaste réseau de dendrites a été clairement observé au microscope confocal à fluorescence. La PCR en temps réel a montré que les niveaux d’ARNm de Pdpn et Dmp1 ont continuellement augmenté pendant 3 semaines. À la semaine 4, le stéréomicroscope a révélé un gel opaque rempli de particules minérales, ce qui correspond au test de fluorescence X (XRF). Ces résultats indiquent que cette matrice de culture facilite avec succès la transition des ostéoblastes vers les ostéocytes matures.

Introduction

Les ostéocytes sont des cellules différenciées en phase terminale dérivées d’ostéoblastes ^1,2. Une fois que l’ostéoblaste est enterré par l’ostéoïde, il subit une ostéocytogenèse et exprime le gène Pdpn pour former des préostéocytes, le gène Dmp1 pour ^{minéraliser l’ostéoïde, et les} gènes Sost et Fgf23 pour fonctionner comme un ostéocyte mature dans le tissu osseux³. Ici, un système de culture 3D est introduit pour identifier l’extension de la dendrite et l’expression des gènes marqueurs dans le processus d’ostéocytogenèse.

Les cellules IDG-SW3 sont une lignée cellulaire primaire immortalisée dérivée de souris transgéniques et peuvent étendre ou répliquer l’ostéoblaste à la différenciation tardive des ostéocytes lorsqu’elles sont cultivées dans différents milieux⁴. Par rapport à MLO-A5, MLO-Y4 et à d’autres lignées cellulaires, le profil d’expression des protéines fonctionnelles, la capacité à effectuer un dépôt de sels de calcium et les réponses à diverses hormones dans les cellules IDG-SW3 sont plus susceptibles d’être les mêmes que celles des ostéocytes primaires dans le tissu osseux⁴.

Par rapport aux systèmes 2D, les systèmes de culture 3D sont plus capables d’imiter l’environnement de croissance cellulaire in vivo, y compris le gradient de nutriments, la faible rigidité mécanique et la plage mécanique environnante (tableau 1). La plupart des méthodes précédentes de culture de cellules ostéoblastiques dans un système 3D utilisaient le collagène I comme composant unique dans les formulations ^4,5,6, car les fibres de collagène I servent de site de dépôt de calcium et de phosphore. Cependant, un constituant indispensable de l’ostéoïde, la matrice extracellulaire, contient un grand groupe de facteurs cellulaires qui favorisent la croissance, l’adhésion et la migration cellulaires ^7,8 et est transparent et pratique pour l’observation par imagerie. Ainsi, ce protocole utilise le Matrigel (ci-après dénommé matrice membranaire basale) comme composant secondaire pour l’étude de l’ostéocytogenèse.

Protocol

Ce protocole est adapté à la culture de cellules dans quatre puits de plaques de 24 puits. Si vous préparez plusieurs échantillons ou plaques, les quantités de réactifs doivent être augmentées en conséquence. 1. Préparation du mélange de collagène I REMARQUE : Le collagène I et la matrice de la membrane basale se gèrent rapidement à température ambiante. Par conséquent, le collagène doit être manipulé sur de la glace (2 °C à 8 ?…

Representative Results

Après coloration des cellules vivantes/mortes, les cellules ont été visualisées à l’aide d’un microscope laser confocal. Toutes les cellules étaient positives pour la calcéine AM (couleur verte), et il n’y avait presque pas de cellules EthD-1 positives (couleur rouge) dans le champ, ce qui indique que le système de gel fabriqué par cette méthode est très approprié pour l’ostéocytogenèse (Figure 1A, à gauche). Pour mieux déterminer la distribution spatiale des cellules…

Discussion

Un point critique de ce protocole est que les étapes 1 et 2 doivent être effectuées sur de la glace pour éviter la coagulation spontanée. Dans cette méthode, la concentration finale de collagène I était de 1,2 mg/mL. Ainsi, un volume optimal de ddH₂O doit être calculé pour correspondre aux différents collagènes de différents fabricants.

In vivo, l’ostéocytogenèse implique un mouvement polaire des ostéoblastes de la surface vers l’intérieur de l’os tra…

Materials

0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422