三维细胞外基质中的 IDG-SW3 细胞培养

Summary

在这里，我们提出了一种在三维（3D）细胞外基质中培养IDG-SW3细胞的方案。

Abstract

骨细胞被认为是从成骨细胞终末分化的非增殖细胞。嵌入骨细胞外基质（类骨质）中的成骨细胞表达 Pdpn 基因形成细胞树突并转化为骨前细胞。后来，前骨细胞表达 Dmp1 基因以促进基质矿化，从而转化为成熟的骨细胞。这个过程称为骨细胞生成。IDG-SW3 是一种用于骨细胞生成 体外 研究的知名细胞系。以前的许多方法都使用胶原I作为培养基质的主要或唯一成分。然而，除了I.型胶原外，类骨质还含有一种基础物质，它是促进细胞生长、粘附和迁移的重要成分。此外，基质物质是透明的，这增加了胶原I形成的凝胶的透明度，从而有助于通过成像技术探索枝晶的形成。因此，本文详细介绍了使用细胞外基质和胶原 I 建立 3D 凝胶以用于 IDG-SW3 存活的方案。在这项工作中，分析了骨细胞发生过程中树突的形成和基因表达。成骨培养 7 天后，在荧光共聚焦显微镜下清晰地观察到广泛的树突网络。实时荧光定量PCR结果显示， Pdbn 和 Dmp1 的mRNA水平持续升高3周。在第 4 周，体视显微镜显示一种充满矿物颗粒的不透明凝胶，与 X 射线荧光 （XRF） 测定一致。这些结果表明，该培养基质成功地促进了从成骨细胞到成熟骨细胞的转变。

Introduction

骨细胞是来源于成骨细胞的终末分化细胞 ^1,2。一旦成骨细胞被类骨质掩埋，它就会发生骨细胞生成并表达 Pdpn 基因形成前骨细胞，表达 Dmp1 基因使类骨质^矿化，并表达 Sost 和 Fgf23 基因在骨组织中作为成熟骨细胞发挥作用³.本文介绍了一种3D培养系统，用于鉴定骨细胞生成过程中的树突延伸和标记基因表达。

IDG-SW3 细胞是一种来源于转基因小鼠的永生化原代细胞系，在不同培养基中培养时，可以扩增或复制成骨细胞至晚期骨细胞分化⁴。与MLO-A5、MLO-Y4等细胞系相比，IDG-SW3细胞中功能蛋白的表达谱、进行钙盐沉积的能力以及对各种激素的反应更可能与骨组织中原代骨细胞相同⁴。

与 2D 系统相比，3D 培养系统更能模拟体内细胞生长环境，包括营养梯度、低机械刚度和周围机械范围（表 1）。以前在3D系统中培养成骨细胞的大多数方法都使用胶原I作为配方^4,5,6中的独特成分^，因为胶原I纤维是钙和磷沉积的位点。然而，类骨质中不可或缺的成分，即细胞外基质，含有一大类促进细胞生长、粘附和迁移的细胞因子^7,8，^并且是透明的^，便于成像观察。因此，该协议使用基质胶（以下简称基底膜基质）作为骨细胞发生研究的次要组分。

Protocol

该方案适用于在24孔板的四个孔中培养细胞。如果制备多个样品或板，则应相应增加试剂的量。 1.胶原蛋白I混合物的制备 注：胶原蛋白I和基底膜基质凝胶在室温下快速。因此，胶原蛋白应在冰上处理（2°C至8°C）。除非另有说明，否则所有使用的吸头和管子都必须预冷。所有程序都应在安全罩中执行。 将所有试剂和离心管放在冰上。…

Representative Results

活细胞/死细胞染色后，使用共聚焦激光显微镜观察细胞。所有细胞均为钙黄绿素AM阳性（绿色），现场几乎没有EthD-1阳性细胞（红色），表明该方法制备的凝胶系统非常适合骨细胞生成（图1A，左）。为了更好地确定细胞的空间分布，选择伪彩色图像来显示凝胶不同深度的细胞树突;红色表示凝胶底部的树突，蓝色表示顶部的树突。结果表明，IDG-SW3细胞在该细胞凝胶基质中生…

Discussion

该协议的一个关键点是步骤1和步骤2必须在冰上进行，以防止自发凝血。在该方法中，胶原蛋白I的最终浓度为1.2 mg/mL。因此，应计算出最佳的 ddH₂O 体积，以匹配来自不同制造商的不同胶原蛋白。

在体内，成骨细胞涉及成骨细胞从小梁骨表面到内部的极性运动¹⁴。该协议使细胞免于在没有定向极性的基质中生长。当然，在无细胞凝胶基质表面接…

Materials

0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422