IDG-SW3 3차원 세포외 기질에서의 세포 배양
Summary
여기에서는 3차원(3D) 세포외 기질에서 IDG-SW3 세포를 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
골세포는 조골세포에서 말단으로 분화된 비증식성 세포로 간주됩니다. 뼈 세포외 기질(osteoid)에 내장된 조골세포는 Pdpn 유전자를 발현하여 세포 수상돌기를 형성하고 전골세포로 변형됩니다. 나중에, 전골세포는 Dmp1 유전자를 발현하여 기질 광물화를 촉진하여 성숙한 골세포로 변형시킵니다. 이 과정을 골세포 형성이라고 합니다. IDG-SW3는 골세포 형성의 시험관 내 연구를 위한 잘 알려진 세포주입니다. 이전의 많은 방법은 콜라겐 I을 배양 매트릭스의 주요 또는 유일한 구성 요소로 사용했습니다. 그러나 골골에는 콜라겐 I 외에도 세포 성장, 접착 및 이동을 촉진하는 중요한 구성 요소인 지상 물질도 포함되어 있습니다. 또한 매트릭스 물질은 투명하여 콜라겐 I 형성 겔의 투명도를 높이고 이미징 기술을 통해 수상돌기 형성을 탐색하는 데 도움이 됩니다. 따라서 이 논문은 IDG-SW3 생존을 위해 콜라겐 I과 함께 세포외 기질을 사용하여 3D 겔을 확립하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 연구에서는 골세포 형성 중에 수상돌기 형성과 유전자 발현을 분석했습니다. 7일간의 골형성 배양 후, 형광 컨포칼 현미경으로 광범위한 수상돌기 네트워크가 명확하게 관찰되었습니다. Real-Time PCR은 Pdpn 및 Dmp1 의 mRNA 수준이 3주 동안 지속적으로 증가하는 것을 보여주었습니다. 4주차에 실체현미경은 X선 형광(XRF) 분석과 일치하는 광물 입자로 채워진 불투명 겔을 보여주었습니다. 이러한 결과는 이 배양 매트릭스가 조골세포에서 성숙한 골세포로의 전환을 성공적으로 촉진한다는 것을 나타냅니다.
Introduction
골세포는 조골세포 1,2에서 유래한 말단 분화 세포입니다. 조골세포가 조골세포에 의해 매몰되면 골세포 형성을 거쳐 Pdpn 유전자를 발현하여 전골세포를 형성하고, Dmp1 유전자를 발현하여 골세포를 광물화하고, Sost와 Fgf23 유전자를 발현하여 뼈 조직에서 성숙한 골세포로 기능한다3. 여기에서는 골세포 형성 과정에서 수상돌기 확장 및 마커 유전자 발현을 식별하기 위해 3D 배양 시스템을 도입합니다.
IDG-SW3 세포는 형질전환 마우스에서 유래한 불멸의 1차 세포주이며, 다른 배지에서 배양할 경우 골아세포를 후기 골세포 분화로 확장하거나 복제할 수 있다4. MLO-A5, MLO-Y4 및 기타 세포주와 비교했을 때, 기능성 단백질의 발현 프로파일, 칼슘염 침착 수행 능력, IDG-SW3 세포의 다양한 호르몬에 대한 반응은 뼈 조직의 일차 골세포와 동일할 가능성이 더 높다4.
2D 시스템에 비해 3D 배양 시스템은 영양 구배, 낮은 기계적 강성 및 주변 기계적 범위를 포함하여 생체 내 세포 성장 환경을 더 잘 모방할 수 있습니다(표 1). 3D 시스템에서 조골세포 세포를 배양하기 위한 대부분의 이전 방법은 콜라겐 I 섬유가 칼슘 및 인 침착 부위 역할을 하기 때문에 제형 4,5,6의 고유한 구성 요소로 콜라겐 I을 사용했습니다. 그러나 골골의 필수 구성 요소인 세포외 기질은 세포 성장, 접착 및 이동을 촉진하는 많은 세포 인자 그룹을 포함하고 있으며(7,8) 투명하고 이미징 관찰에 편리합니다. 따라서 이 프로토콜은 골세포 형성 연구를 위한 2차 구성 요소로 Matrigel(이하 기저막 매트릭스라고 함)을 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 중요한 점은 자연 응고를 방지하기 위해 1단계와 2단계를 얼음 위에서 수행해야 한다는 것입니다. 이 방법에서 콜라겐 I의 최종 농도는 1.2mg/mL였습니다. 따라서 최적의 ddH2O 부피는 다양한 제조업체의 다양한 콜라겐과 일치하도록 계산되어야 합니다.
생체 내에서, 골세포 형성은 섬유주 뼈의 표면에서 내부로 조골세포의 극성 이동을 포함한다<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IDG-SW3 세포주를 기증해 주신 Lynda F. Bonewald 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82070902, 82100935, 81700778)과 상하이 “과학 기술 혁신”항해 프로젝트 (21YF1442000)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
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