Клеточная культура IDG-SW3 в трехмерном внеклеточном матриксе

Summary

Здесь мы представляем протокол культивирования клеток IDG-SW3 в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе.

Abstract

Остеоциты считаются непролиферативными клетками, которые терминально дифференцируются от остеобластов. Остеобласты, встроенные в костный внеклеточный матрикс (остеоид), экспрессируют ген Pdpn с образованием клеточных дендритов и превращением в преостеоциты. Позже преостеоциты экспрессируют ген Dmp1 , способствуя минерализации матрикса и, таким образом, превращаясь в зрелые остеоциты. Этот процесс называется остеоцитогенезом. IDG-SW3 — хорошо известная клеточная линия для исследований остеоцитогенеза in vitro . Во многих предыдущих методах коллаген I использовался в качестве основного или единственного компонента культивируемого матрикса. Однако, помимо коллагена I, остеоид также содержит основное вещество, которое является важным компонентом, способствующим клеточному росту, адгезии и миграции. Кроме того, матричное вещество прозрачно, что повышает прозрачность коллагенового геля I-образного типа и, таким образом, помогает исследовать образование дендритов с помощью методов визуализации. Таким образом, в данной работе подробно описан протокол создания 3D-геля с использованием внеклеточного матрикса вместе с коллагеном I для выживания IDG-SW3. В данной работе были проанализированы дендритообразование и экспрессия генов в процессе остеоцитогенеза. Через 7 дней остеогенного культивирования под флуоресцентным конфокальным микроскопом отчетливо наблюдалась обширная дендритная сеть. ПЦР в реальном времени показала, что уровни мРНК Pdpn и Dmp1 непрерывно повышались в течение 3 недель. На 4-й неделе стереомикроскоп показал непрозрачный гель, заполненный минеральными частицами, что соответствовало рентгенофлуоресцентному анализу (XRF). Эти результаты свидетельствуют о том, что данный культуральный матрикс успешно способствует переходу от остеобластов к зрелым остеоцитам.

Introduction

Остеоциты представляют собой терминально дифференцированные клетки, полученные из остеобластов ^1,2. После того, как остеобласт погребен остеоидом, он подвергается остеоцитогенезу и экспрессирует ген Pdpn для образования преостеоцитов, ген Dmp1 для ^{минерализации остеоида} и гены Sost и Fgf23 для функционирования в качестве зрелого остеоцита в костной ткани³. Здесь используется система 3D-культивирования для выявления удлинения дендритов и экспрессии генов-маркеров в процессе остеоцитогенеза.

Клетки IDG-SW3 представляют собой иммортализированную первичную клеточную линию, полученную от трансгенных мышей, и могут расширяться или реплицировать остеобласт до поздней дифференцировки остеоцитов при культивировании в различных средах⁴. По сравнению с MLO-A5, MLO-Y4 и другими клеточными линиями, профиль экспрессии функциональных белков, способность выполнять отложение солей кальция и реакция на различные гормоны в клетках IDG-SW3 с большей вероятностью будут такими же, как у первичных остеоцитов в костной ткани⁴.

По сравнению с 2D-системами, 3D-системы культивирования более способны имитировать среду клеточного роста in vivo, включая градиент питательных веществ, низкую механическую жесткость и окружающий механический диапазон (Таблица 1). Большинство предыдущих методов культивирования остеобластических клеток в 3D-системе использовали коллаген I в качестве уникального компонента в рецептурах ^4,5,6, поскольку волокна коллагена I служат местом отложения кальция и фосфора. Тем не менее, незаменимый компонент остеоида, внеклеточный матрикс, содержит большую группу клеточных факторов, которые способствуют клеточному росту, адгезии и миграции ^7,8 и является прозрачным и удобным для визуализирующего наблюдения. Таким образом, в этом протоколе используется Matrigel (далее именуемый матрицей базальной мембраны) в качестве вторичного компонента для исследования остеоцитогенеза.

Protocol

Этот протокол подходит для культивирования клеток в четырех лунках 24-луночных планшетов. При подготовке нескольких образцов или планшетов количество реагентов должно быть соответственно увеличено. 1. Приготовление коллагеновой смеси I ПРИМЕЧАНИ?…

Representative Results

После окрашивания живых/мертвых клеток клетки визуализировали с помощью конфокального лазерного микроскопа. Все клетки были кальцеин-AM-положительными (зеленый цвет), а EthD-1-положительных клеток (красный цвет) в полевых условиях почти отсутствовали, что указывает на то, что гелевая сист?…

Discussion

Критическим моментом в этом протоколе является то, что шаги 1 и шаг 2 должны выполняться на льду, чтобы предотвратить спонтанную коагуляцию. В этом методе конечная концентрация коллагена I составила 1,2 мг/мл. Таким образом, оптимальный объем_ddH2Oдолжен быть рассчитан в соответствии с …

Materials

0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422