인간 전립선암 세포의 심장내 주사를 통해 뼈 전이 이종이식 마우스 모델 생성
Summary
여기서, 본 발명자들은 골전이 병변이 있는 마우스 모델을 생성하기 위해 인간 전립선암 세포의 심장내 주사를 위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
가장 흔한 남성 악성 종양인 전립선암(PC)은 주로 65%-75%의 뼈 전이율로 인해 사망률 2위를 차지합니다. 따라서 새로운 치료제 개발을 위해서는 전립선암 골전이의 과정 및 관련 기전을 이해하는 것이 필수적이다. 이를 위해서는 뼈 전이의 동물 모델이 필수적인 도구입니다. 여기에서는 전립선암 세포의 심장 내 주사를 통해 뼈 전이 마우스 모델을 생성하는 자세한 절차를 보고합니다. 생물발광 이미징 시스템은 전립선암 세포가 심장에 정확하게 주입되었는지 여부를 확인하고 전이성 병변 발달을 모니터링하는 데 큰 이점이 있기 때문에 암세포 전이를 모니터링할 수 있습니다. 이 모델은 파종된 암세포의 자연적 발달을 복제하여 뼈에 미세 전이를 형성하고 전립선암 뼈 전이의 병리학적 과정을 모방합니다. 그것은 이 질병의 분자 메커니즘과 생체 내 치료 효과에 대한 추가 탐색을 위한 효과적인 도구를 제공합니다.
Introduction
전립선 암은 112 국가에서 남성에게 가장 흔한 암이며 인간 발달 지수가 높은 국가 1,2에서 사망률 2 위를 차지했습니다. 전립선암 환자의 대부분의 사망은 전이에 의해 발생하며, 사례의 약 65%-75%는 뼈 전이가 발생합니다 3,4. 따라서 전립선암 환자의 임상 결과를 개선하기 위해서는 전립선암 골 전이의 예방 및 치료가 시급하다. 뼈 전이의 동물 모델은 전립선암 뼈 전이의 각 단계에 관여하는 다단계 과정과 분자 메커니즘을 탐색하여 치료 표적을 식별하고 새로운 치료법을 개발하는 데 없어서는 안될 도구입니다5.
전립선암 골 전이의 실험 동물 모델을 생성하는 가장 일반적인 방법은 전립선암 세포의 동소, 골내 (예: 경골내) 및 심장내 주사를 포함한다. 동소 주사를 이용한 골 전이 모델은 전립선암 세포를 마우스의 전립선에 직접 주입함으로써 생성된다 6,7. 이 실험 동물 모델은 전립선암 뼈 전이와 매우 유사한 임상적 특징을 가지고 있습니다. 그러나 전이는 주로 뼈보다는 겨드랑이 림프절과 폐에서 발생합니다 8,9. 전립선암에 대한 경골내 주사 모델은 뼈(경골)의 종양 형성률이 높은 전립선암 세포를 경골에 직접 주입합니다10,11; 그러나 뼈 피질과 골수강은 쉽게 손상됩니다. 또한, 경골 주사 방법은 암세포가 순환을 통해 뼈를 식민지화하는 전립선암 뼈 전이의 병리학적 과정을 자극할 수 없습니다. 암세포의 골전이율이 높은 순환순환, 혈관혈관외유출, 원격전이를 조사하기 위해 전립선암세포를 마우스의 좌심실에 직접 주입하는 심장내 주사기법이 개발되었다 8,12,13. 이것은 뼈 전이 연구를 위한 귀중한 동물 모델이 된다8. 심장 내 주사 방법은 약 75%의 골 전이율을 보이며9,14 동소 주사 방법보다 훨씬 높습니다. 따라서, 심장내 주사는 전립선암 동물모델을 생성하는데 이상적인 방법이다.
이 작업은 전립선암 뼈 전이의 마우스 모델을 구축하는 과정을 설명하여 독자가 모델 설정을 시각화할 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다. 현재 작업은 무흉선 마우스에서 인간 전립선암 세포의 심장 내 주입을 통해 뼈 전이 이종 이식 모델을 생성하기 위한 자세한 프로세스, 예방 조치 및 예시 사진을 제공합니다. 이 방법은 전립선암 골 전이의 분자 메커니즘 및 생체 내 치료 효과를 추가로 탐색하기 위한 효과적인 도구를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
골 전이를 발생시키는 인간 전립선암 세포의 심장내 주사는 전립선암 골 전이의 기능 및 메커니즘을 탐색하고 치료 효능을 평가하기 위한 이상적인 마우스 모델이다. 연구에 따르면 뼈 손상은 근위 경골과 원위 대퇴골17에서 발생할 가능성이 가장 높으며, 이는 높은 혈관 형성 및 대사 활동 때문일 수 있습니다.
뼈 전이는 유방암 환자에서 빈번하게 관찰되는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2018YFC1704300 및 2020YFE0201600), 국립 자연 과학 재단(81973877 및 82174408), 상하이 중의과 대학(2021LK047) 예산 내 연구 프로젝트, 상하이 병원 TCM 준비 산업 혁신 협력 혁신 센터.
Materials
| 1 mL syringes and needles | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | The cells were injected into the ventricles of mice |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | Equipment for anesthetizing mice |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | For counting cells |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | Male | 6-8 week old, male mice |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | |
| EDTA solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1105 | For decalcification of bone tissure |
| F-12 medium | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 21700075, GIBCO | Cell culture medium |
| Formalin solution | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | BL539A | For fixing the specimen of each mouse |
| Isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | For anesthesia |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027, Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| PC-3 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | TCHu 158 | Prostate cancer cell line |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | Wash the human osteosarcoma cells |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | For detaching the cells |
| Vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid for transfection |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | For obtaining x-ray images to detect tumor growth |
| μCT80 | Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd | Scanco Medical AG,Switzerland | For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction, and μCT Ray V3.4A model visualization software. |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer Cancerstatistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, R. E. Skeletal complications of malignancy. Cancer. 80, 1588-1594 (1997).
- Macedo, F., et al. Bone metastases: An overview. Oncology Reviews. 11 (1), 321 (2017).
- Rea, D., et al. Mouse models in prostate cancer translational research: From xenograft to PDX. BioMed Research International. 2016, 9750795 (2016).
- Zhang, Y., et al. Real-time GFP intravital imaging of the differences in cellular and angiogenic behavior of subcutaneous and orthotopic nude-mouse models of human PC-3 prostate cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (11), 2546-2551 (2016).
- Stephenson, R. A., et al. Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice. Journal of the National Cancer Institute. 84 (12), 951-957 (1992).
- Simmons, J. K., et al. Animal models of bone metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Research: BCR. 7 (4), 444-454 (2005).
- Corey, E., et al. Establishment and characterization of osseous prostate cancer models: intra-tibial injection of human prostate cancer cells. The Prostate. 52 (1), 20-33 (2002).
- Andersen, C., Bagi, C. M., Adams, S. W. Intra-tibial injection of human prostate cancer cell line CWR22 elicits osteoblastic response in immunodeficient rats. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 3 (2), 148-155 (2003).
- Sudhan, D. R., Pampo, C., Rice, L., Siemann, D. W. Cathepsin L inactivation leads to multimodal inhibition of prostate cancer cell dissemination in a preclinical bone metastasis model. International Journal of Cancer. 138 (11), 2665-2677 (2016).
- Jinnah, A. H., Zacks, B. C., Gwam, C. U., Kerr, B. A. Emerging and established models of bone metastasis. Cancers. 10 (6), 176 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo. The Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. 癌症研究. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Brylka, L., et al. Spine Metastases in immunocompromised mice after intracardiac injection of MDA-MB-231-SCP2 breast cancer cells. Cancers. 14 (3), 556 (2022).
- Rahman, M. M., Veigas, J. M., Williams, P. J., Fernandes, G. DHA is a more potent inhibitor of breast cancer metastasis to bone and related osteolysis than EPA. Breast Cancer Research and Treatment. 141 (3), 341-352 (2013).
- Park, S. I., Kim, S. J., McCauley, L. K., Gallick, G. E. Pre-clinical mouse models of human prostate cancer and their utility in drug discovery. Current Protocols in Pharmacology. , (2010).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Fearon, K. C., Glass, D. J., Guttridge, D. C. Cancer cachexia: mediators, signaling, and metabolic pathways. Cell Metabolism. 16 (2), 153-166 (2012).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21 (11), 1262-1271 (2015).
- Talbot, S. R., et al. Defining body-weight reduction as a humane endpoint: a critical appraisal. Laboratory Animals. 54 (1), 99-110 (2020).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Yin, J. J., et al. TGF-beta signaling blockade inhibits PTHrP secretion by breast cancer cells and bone metastases development. The Journal of Clinical Investigation. 103 (2), 197-206 (1999).
- Schneider, A., et al. turnover mediates preferential localization of prostate cancer in the skeleton. Endocrinology. 146 (4), 1727-1736 (2005).
- Padalecki, S. S., et al. Chromosome 18 suppresses prostate cancer metastases. Urologic Oncology. 21 (5), 366-373 (2003).
