Sistema di rilevamento del virus del DNA basato su RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e Deep Learning
Summary
Presentiamo un protocollo che combina l’amplificazione della polimerasi ricombinasi con un sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA e costruisce una microscopia portatile per smartphone con una classificazione assistita dall’intelligenza artificiale per il rilevamento di virus a DNA point-of-care.
Abstract
Segnaliamo un sistema di rilevamento del DNA virus veloce, facile da implementare, altamente sensibile, specifico per la sequenza e point-of-care (POC), che combina l’amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA) e il sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA. Il DNA bersaglio viene amplificato e riconosciuto separatamente da RPA e CRISPR/Cas12a, che innesca l’attività di scissione collaterale di Cas12a che slega un reporter di DNA marcato con fluoroforo e generalizza la fluorescenza. Per il rilevamento POC, la microscopia portatile per smartphone è progettata per acquisire immagini fluorescenti. Inoltre, all’interno del sistema vengono implementati modelli di deep learning per la classificazione binaria di campioni positivi o negativi, ottenendo un’elevata precisione. Il virus della rana 3 (FV3, generi Ranavirus, famiglia Iridoviridae) è stato testato come esempio per questo sistema di rilevamento POC del virus a DNA e i limiti di rilevamento (LoD) possono raggiungere 10 aM entro 40 minuti. Senza operatori qualificati e strumenti ingombranti, l’RPA-CRISPR/Cas12a-SPM portatile e miniaturizzato con classificazione assistita dall’intelligenza artificiale (AI) mostra un grande potenziale per il rilevamento del virus POC DNA e può aiutare a prevenire la diffusione di tali virus.
Introduction
Negli ultimi anni si sono verificate frequentemente epidemie di malattie infettive causate da diversi virus, tra cui l’epidemia di malattia da virus Ebola (EVD) nel 20141 e nel 20182, la sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS) nel 20153, l’epidemia di malattia da virus Zika nel 20154, la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)5 e il continuo vaiolo delle scimmie causato dal virus del vaiolo delle scimmie (MKPV) nel 20226. Questi improvvisi focolai di malattie infettive epidemiche causano un gran numero di morti e portano enormi perdite economiche e disordini sociali. È urgentemente necessario un sistema di rilevamento rapido e accurato per diagnosticare rapidamente l’infezione e prevenire l’ulteriore diffusione del virus.
Recentemente, le brevi ripetizioni palindromiche (CRISPR) e le proteine associate a CRISPR (Cas) hanno guadagnato l’attenzione di tutto il mondo e hanno mostrato risultati promettenti nella rilevazione degli acidi nucleici 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . La proteina CRISPR/Cas12a, guidata dall’RNA CRISPR (crRNA), si lega e scinde il DNA bersaglio. Questa attività porta al rilascio di DNA a filamento singolo (ssDNA) aspecifico, noto come trans-scissione, e può essere utilizzata per migliorare il segnale di rilevamento per il rilevamento dell’acido nucleico. Alcuni metodi di rilevamento tradizionali come la reazione a catena della polimerasi (PCR), la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) e il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) sono complicati, dispendiosi in termini di tempo e costosi per il rilevamento point-of-care (POC). Il nostro lavoro precedente ha sviluppato con successo un sistema di rilevamento automatizzato, integrato ed economico per il virus della peste suina africana (ASFV) basato sulla tecnologia CRISPR/Cas12a. In questo sistema, abbiamo raggiunto un limite di rilevamento di 1 pM in un intervallo di tempo di 2 ore senza la necessità di amplificazione. Il sistema CRISPR/Cas12a e l’amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) sono combinati per migliorare la sensibilità e la specificità per il rilevamento di tracce di DNA. Rispetto ad altre tecniche di amplificazione isotermica, l’RPA è semplice nel design e conveniente nel funzionamento poiché ha un tempo di reazione più breve senza sofisticate apparecchiature di controllo della temperatura.
Per il rilevamento POC di agenti patogeni, vengono sviluppati strumenti come la microscopia per smartphone (SPM), il fluorimetro portatile o le strisce a flusso laterale per le letture dei risultati 16,17,18. SPM cattura le immagini attraverso una fotocamera e le carica su alcune applicazioni mobili per una rapida analisi dei dati. Tale microscopia rende un sistema di acquisizione del segnale portatile, economico e miniaturizzato con un’elevata sensibilità e ha mostrato vantaggi nel rilevare agenti patogeni come H5N1, il virus Zika e SARS-CoV-219,20. Pertanto, costruiamo un SPM portatile per catturare i segnali di fluorescenza innescati dal rilevamento RPA-CRISPR/Cas12a del virus a DNA bersaglio. La sonda reporter ssDNA che collega un fluoroforo e un quencher verrà tagliata quando CRISPR/Cas12a riconosce il virus a DNA bersaglio e la fluorescenza emessa dal fluoroforo può essere catturata da SPM.
Rispetto al software professionale solitamente utilizzato per ottenere le informazioni sui risultati dalle immagini a fluorescenza di SPM21, alcuni esperti utilizzano l’apprendimento automatico e l’apprendimento profondo per quantificare le concentrazioni di DNA virale dopo aver ottenuto immagini a fluorescenza22, il che richiede più tempo. Quando si tratta di classificare le immagini mediche, le reti neurali convenzionali (CNN) vengono spesso utilizzate per apprendere le caratteristiche dalle immagini pixelate grezze in modo end-to-end 23,24,25,26. I popolari modelli di deep learning basati su CNN come AlexNet, DenseNet-121 ed EfficientNet-B7 sono stati applicati con successo in questo campo27,28. Tuttavia, ottenere grandi set di dati in domini specifici può essere impegnativo, richiedendo l’apprendimento del trasferimento29,30. Questo approccio esegue il pre-training di un modello di deep learning con un set di dati di grandi dimensioni e il modello pre-addestrato viene utilizzato come punto di partenza per una nuova attività con un set di dati di piccole dimensioni. Questa tecnica può ridurre la necessità di grandi set di dati, combattere l’overfitting e ridurre i tempi di addestramento31. In questo caso, utilizziamo modelli di deep learning con transfer learning per la classificazione binaria delle immagini di fluorescenza dei campioni positivi e negativi.
In questo metodo, combiniamo RPA e il sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA. Il DNA bersaglio viene amplificato e riconosciuto separatamente da RPA e CRISPR/Cas12a, che innesca l’attività di scissione collaterale di Cas12a che slega un reporter di DNA marcato con fluoroforo e generalizza la fluorescenza. Costruiamo un SPM portatile per acquisire le immagini fluorescenti per il rilevamento POC e sviluppiamo modelli di deep learning per la classificazione binaria. Lo schema del sistema di rilevamento POC integrato è mostrato nella Figura 1. Senza operatori qualificati e strumenti ingombranti, l’RPA-CRISPR/Cas12a-SPM con classificazione assistita dall’intelligenza artificiale (AI) mostra un grande potenziale per il rilevamento del virus POC DNA.
Figura 1: Lo schema del sistema di rilevamento RPA-CRISPR/Cas12-SPM insieme alla classificazione AI per le immagini raccolte. Gli acidi nucleici dei campioni di origine animale vengono rilasciati da PINDBK. Il DNA bersaglio del virus viene amplificato e riconosciuto in modo specifico dal sistema RPA-CRISPR/Cas12a. CRISPR/Cas12a si lega al crRNA e il complesso Cas12a-crRNA si lega al DNA bersaglio, che innesca la scissione collaterale di CRISPR/Cas12a sulle sonde reporter ssDNA. Il fluoroforo sul reporter viene rilasciato e la fluorescenza viene rilevata da un lettore di piastre commercializzato o dall’SPM che costruiamo. Per classificare le immagini a fluorescenza vengono utilizzati tre diversi modelli di deep learning, tra cui AlexNet, DenseNet-121 ed EfficientNet-B7 con transfer learning. Questa figura è riutilizzata con il permesso di Lei et al.35. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con questo metodo, sviluppiamo un sistema di rilevamento del virus a DNA veloce, facile da implementare, altamente sensibile, specifico per la sequenza e POC con l’assistenza dell’intelligenza artificiale. Dopo aver ottenuto i campioni, viene applicata RPA per amplificare la sequenza target, quindi CRISPR/Cas12a può riconoscere il DNA target e rilasciare fluorescenza, che amplia il segnale di rilevamento. La microscopia portatile per smartphone è costruita per acquisire immagini a fluorescenza e i modelli di deep learn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China 31970752, Science, Technology, Innovation Commission of Shenzhen Municipality JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Finanziamento aperto del laboratorio della baia di Shenzhen, SZBL2020090501004; Fondazione scientifica post-dottorato cinese 2020M680023; e Amministrazione generale delle dogane della Repubblica popolare cinese 2021HK007.
Materials
| 20x amplification | OLYMPUS | OPLN20X | |
| 532 nm green laser | Thorlabs | PL201 | with 0.9 mW output power |
| 535 nm cutoff wavelength | chrome | AT535 | |
| 6x DNA loading buffer | Thermo scientific | R0611 | |
| 96-well black microplate | Corning Incorporated | 3603 | Black with flat clear bottom |
| Aspherical lens | Lubang | N/A | |
| Bandpass filter | SEMROCK | FF01-542/27-25 | |
| Bsu DNA Polymerase | ATG Biotechnology | M103 | Large Fragment |
| crRNA | Sangon Biotech | N/A | |
| DNA fragments | Sangon Biotech | N/A | |
| Dichroic holders | Ruicage | N/A | |
| Dichroic mirror | SEMROCK | FF555-Di03-25×36 | with a cutoff wavelength of 535 nm |
| E.Z.N.A Gel Extraction Kit | Omega Biotek | D2500-02 | |
| EnGen Lba Cas12a (Cpf1) | New England Biolabs (Beijing) LTD | M0653T | |
| Filter holders | Ruicage | N/A | |
| Fluorophore-ssDNA-Quencher reporter probes | Sangon Biotech | N/A | TAMRA (carboxy tetramethylrhodamine) as the fluorophore at the 5 ends; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) as the quencher at the 3 ends |
| GP32 | ATG Biotechnology | M104 | |
| ImageJ | Open-source | Version 1.53t 24 | Downloaded from https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Microplate reader | SPARK, TECAN | N/A | |
| Multi-Block thermal Cycler PCR instrument | LongGene | N/A | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| NEBuffer r2.1 | New England Biolabs (Beijing) LTD | B6002S | 10x CRISPR/Cas12a Reaction buffer |
| Oxygen plasma treatment | Electro-Technic Products | N/A | |
| Pathogen Inactivate, Nucleic acid extraction-free, Direct-to-PCR Buffer with Proteinase K (PINDBK) | Ebio | PINDBK -25mL | |
| PCR primer pairs | Sangon Biotech | N/A | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| RPA primer pairs | Sangon Biotech | N/A | |
| Smartphone | Huawei | Mate10 | |
| Translation stages | Ruicage | N/A | |
| Transmitted neutral density filters | Thorlabs | ND40A | |
| Triplet achromatic lenses | Thorlabs | TRH127-020-A | |
| UvsX | ATG Biotechnology | M105 | |
| UvsY | ATG Biotechnology | M106 |
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