تقييم الاستجابة المناعية للقاح مساعد مستحلب نانوي ضد عدوى المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA)
Summary
يعد البروتوكول الحالي ويقيم الخصائص الفيزيائية والاستجابة المناعية والتأثير الوقائي في الجسم الحي للقاح مساعد مستحلب نانوي جديد.
Abstract
جذبت اللقاحات المساعدة للمستحلب النانوي اهتماما واسعا بسبب صغر حجم الجسيمات واستقرارها الحراري العالي وقدرتها على تحفيز استجابات مناعية صحيحة. ومع ذلك ، فإن إنشاء سلسلة من البروتوكولات الشاملة لتقييم الاستجابة المناعية للقاح مساعد مستحلب نانوي جديد أمر حيوي. لذلك ، تحتوي هذه المقالة على إجراء صارم لتحديد الخصائص الفيزيائية والكيميائية للقاح (عن طريق المجهر الإلكتروني النافذ [TEM] ، ومجهر القوة الذرية [AFM] ، وتشتت الضوء الديناميكي [DLS]) ، واستقرار مستضد اللقاح والنظام (عن طريق اختبار الطرد المركزي عالي السرعة ، واختبار الاستقرار الديناميكي الحراري ، و SDS-PAGE ، واللطخة الغربية) ، والاستجابة المناعية المحددة (IgG1 ، IgG2a و IgG2b). باستخدام هذا النهج ، يمكن للباحثين تقييم دقيق للتأثير الوقائي للقاح مساعد مستحلب نانوي جديد في نموذج فأر MRSA252 قاتل. باستخدام هذه البروتوكولات ، يمكن تحديد مساعد اللقاح النانوي الواعد من حيث إمكانات المساعدة الفعالة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تساعد الطرق في تحسين اللقاحات الجديدة للتطوير المستقبلي.
Introduction
المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) هي أحد مسببات الأمراض الانتهازية مع واحدة من أعلى معدلات الإصابة في أجنحة وحدة العناية المركزة(ICU) 1 وأقسام أمراض القلب وأقسام الحروق في جميع أنحاء العالم. تظهر MRSA معدلات عالية من العدوى والوفيات ومقاومة واسعة للأدوية ، مما يمثل صعوبات كبيرة في العلاج السريري2. في قائمة الأولويات العالمية للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية الصادرة عن منظمة الصحة العالمية (WHO) في عام 2017 ، تم إدراج MRSA في الفئة3 الأكثر أهمية. لذلك هناك حاجة ماسة إلى لقاح ضد عدوى MRSA.
تم استخدام مادة الألومنيوم المساعدة لفترة طويلة ، والآلية المساعدة المساعدة واضحة نسبيا وآمنة وفعالة وجيدة التحمل4. المواد المساعدة الألومنيوم هي حاليا نوع من المواد المساعدة المستخدمة على نطاق واسع. يعتقد عموما أن المستضدات الممتصة على جزيئات ملح الألومنيوم يمكن أن تحسن الاستقرار وتعزز قدرة موقع الحقن على امتصاص المستضدات ، مما يوفر امتصاصا جيدا وإطلاقا بطيئا5. في الوقت الحالي ، يتمثل العيب الرئيسي للمواد المساعدة المصنوعة من الألومنيوم في أنها تفتقر إلى تأثير مساعد أو تظهر فقط تأثيرا مساعدا ضعيفا على بعض المستضدات المرشحة للقاح6. بالإضافة إلى ذلك ، تحفز المواد المساعدة المصنوعة من الألومنيوم تفاعلات فرط الحساسية بوساطة IgE5. لذلك ، من الضروري تطوير مواد مساعدة جديدة لتحفيز استجابة مناعية أقوى.
المواد المساعدة للمستحلب النانوي هي أنظمة تشتت غروية تتكون من الزيت والماء والمواد الخافضة للتوتر السطحي والمواد الخافضة للتوتر السطحي7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المواد المساعدة مستقرة ديناميكيا حراريا ومتباينة الخواص ، ويمكن تعقيمها أو تثبيتها عن طريق الطرد المركزي عالي السرعة ، ويمكن تشكيلها تلقائيا في ظل ظروف تحضير معتدلة. العديد من المواد المساعدة للمستحلب (مثل MF59 ، سلسلة NB001-002 ، سلسلة AS01-04 ، إلخ) موجودة حاليا في السوق أو في مرحلة البحث السريري ، لكن أحجام جسيماتها أكبر من 160 نانومتر8. لذلك ، لا يمكن استغلال مزايا المستحضرات الطبية النانوية (1-100 نانومتر) (أي مساحة سطح محددة كبيرة ، وحجم الجسيمات الصغير ، وتأثير السطح ، والطاقة السطحية العالية ، وتأثير الحجم الصغير ، وتأثير الأنفاق الكمومية الكلية) بشكل كامل. في البروتوكول الحالي ، تم الإبلاغ عن مادة مساعدة جديدة تعتمد على تقنية المستحلب النانوي بحجم قطر 1-100 نانومتر لإظهار نشاط مساعد جيد9. اختبرنا بروتين مستضد لقاح الوحدة الفرعية لإعادة التركيب HI (α-hemolysin mutant [Hla] وعامل تحديد سطح أيون الحديد B [IsdB] الوحدة الفرعية N2 بروتين اندماج الشظايا النشط) ؛ تم وضع سلسلة من الإجراءات لفحص الخصائص الفيزيائية والاستقرار ، وتقييم استجابة الأجسام المضادة المحددة بعد الإعطاء العضلي ، واختبار التأثير الوقائي للقاح باستخدام نموذج العدوى الجهازية للفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
يلعب IsdB ، وهو بروتين سطحي مثبت على جدار الخلية البكتيرية وينظمه الحديد ، دورا مهما في عملية الحصول على حديدالهيم 15. Hla ، سم ألفا ، هو من بين السموم البكتيرية الأكثر فعالية المعروفة في MRSA ، ويمكن أن تشكل المسام في الخلايا حقيقية النواة وتتداخل مع الالتصاق والخلايا الظه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل رقم 2021YFC2302603 من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين ، ورقم 32070924 و 32000651 من NSFC ، ورقم 2019jcyjA-msxmx0159 من برنامج مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O’Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. . Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
- Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
