Bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) Enfeksiyonuna Karşı İmmün Yanıtının Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının fiziksel özelliklerini, immün yanıtını ve in vivo koruyucu etkisini hazırlar ve değerlendirir.
Abstract
Nanoemülsiyon adjuvan aşıları, küçük partikül boyutları, yüksek termal stabiliteleri ve geçerli bağışıklık tepkilerini indükleme yetenekleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür. Bununla birlikte, yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının bağışıklık tepkisini değerlendirmek için bir dizi kapsamlı protokol oluşturmak hayati önem taşımaktadır. Bu nedenle, bu makale bir aşının fizikokimyasal özelliklerini (iletim elektron mikroskobu [TEM], atomik kuvvet mikroskobu [AFM] ve dinamik ışık saçılması [DLS]), aşı antijeninin ve sisteminin stabilitesini (yüksek hızlı santrifüj testi, termodinamik stabilite testi, SDS-PAGE ve batı lekesi ile) ve spesifik bağışıklık tepkisini (IgG1, IgG2a ve IgG2b). Bu yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar ölümcül bir MRSA252 fare modelinde yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının koruyucu etkisini doğru bir şekilde değerlendirebilirler. Bu protokollerle, etkili adjuvan potansiyeli açısından en umut verici nanoemülsiyon aşısı adjuvanı belirlenebilir. Ek olarak, yöntemler gelecekteki gelişmeler için yeni aşıların optimize edilmesine yardımcı olabilir.
Introduction
Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), yoğun bakım ünitesi (YBÜ) koğuş1, kardiyoloji bölümleri ve yanık bölümlerinde dünya çapında en yüksek enfeksiyon oranlarından birine sahip fırsatçı bir patojendir. MRSA, yüksek enfeksiyon, mortalite oranları ve geniş ilaç direnci göstermekte ve klinik tedavide büyük zorluklar ortaya koymaktadır2. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından 2017 yılında yayınlanan Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin Küresel Öncelik Listesi’nde MRSA, en kritik kategori3’te yer aldı. Bu nedenle MRSA enfeksiyonuna karşı bir aşıya acilen ihtiyaç vardır.
Alüminyum adjuvan uzun süredir kullanılmaktadır ve adjuvan yardımcı mekanizma nispeten açık, güvenli, etkili ve iyi tolere edilir4. Alüminyum adjuvanlar şu anda yaygın olarak kullanılan bir adjuvan türüdür. Genel olarak, alüminyum tuzu parçacıkları üzerinde adsorbe edilen antijenlerin stabiliteyi artırabileceğine ve enjeksiyon bölgesinin antijenleri alma yeteneğini artırabileceğine, iyi emilim ve yavaş salınım sağlayabileceğine inanılmaktadır5. Şu anda, alüminyum adjuvanların ana dezavantajı, adjuvan bir etkiye sahip olmamaları veya bazı aşı adayıantijenler 6 üzerinde sadece zayıf bir adjuvan etki göstermeleridir. Ek olarak, alüminyum adjuvanlar IgE aracılı aşırı duyarlılık reaksiyonlarını indükler5. Bu nedenle, daha güçlü bir bağışıklık tepkisini uyarmak için yeni adjuvanlar geliştirmek gerekir.
Nanoemülsiyon adjuvanları, yağ, su, yüzey aktif maddeler ve kosürfaktan oluşan kolloidal dispersiyon sistemleridir7. Ek olarak, adjuvanlar termodinamik olarak stabil ve izotropiktir, yüksek hızlı santrifüjleme ile otoklavlanabilir veya stabilize edilebilir ve hafif hazırlık koşulları altında kendiliğinden oluşturulabilir. Birkaç emülsiyon adjuvanı (MF59, NB001-002 serisi, AS01-04 serisi, vb. gibi) şu anda piyasada veya klinik araştırma aşamasındadır, ancak partikül boyutları 160 nm8’den büyüktür. Bu nedenle, nano ölçekli (1-100 nm) tıbbi preparatların avantajları (yani, büyük spesifik yüzey alanı, küçük parçacık boyutu, yüzey etkisi, yüksek yüzey enerjisi, küçük boyut etkisi ve makro kuantum tünelleme etkisi) tam olarak kullanılamaz. Bu protokolde, 1-100 nm çap büyüklüğünde nanoemülsiyon teknolojisine dayanan yeni bir adjuvanın iyi bir adjuvan aktivitesi sergilediği bildirilmiştir9. Rekombinasyon alt birim aşı antijen proteini HI (α-hemolizin mutantı [Hla] ve Fe iyon yüzeyini belirleyen faktör B [IsdB] alt birimi N2 aktif fragman füzyon proteini) test ettik; Fiziksel özellikleri ve stabiliteyi incelemek, intramüsküler uygulamadan sonra spesifik antikor yanıtını değerlendirmek ve bir fare sistemik enfeksiyon modeli kullanarak aşının koruyucu etkisini test etmek için bir dizi prosedür oluşturulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriyel hücre duvarına bağlı ve demir regüle edilmiş bir yüzey proteini olan IsdB, heme demir15’in elde edilmesi sürecinde önemli bir rol oynar. Hla, alfa toksini, MRSA’da bilinen en etkili bakteriyel toksinler arasındadır ve ökaryotik hücrelerde gözenekler oluşturabilir ve yapışma ve epitel hücrelerine müdahale edebilir16. Çalışmamızda, IsdB ve Hla’nın antijen genlerine dayanan gen mühendisliği teknolojisi il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı’nın No. 2021YFC2302603, NSFC’nin No. 32070924 ve 32000651 ve Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Proje Programı’nın No. 2019jcyjA-msxmx0159 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O’Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. . Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
- Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
