메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염에 대한 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응 평가
Summary
본 프로토콜은 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성, 면역 반응 및 생체 내 보호 효과를 준비하고 평가합니다.
Abstract
나노 에멀젼 보조 백신은 작은 입자 크기, 높은 열 안정성 및 유효한 면역 반응을 유도하는 능력으로 인해 광범위한 관심을 끌었습니다. 그러나 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응을 평가하기 위한 일련의 포괄적인 프로토콜을 수립하는 것이 중요합니다. 따라서 이 기사에서는 백신의 물리화학적 특성(투과전자현미경[TEM], 원자력현미경[AFM] 및 동적 광산란[DLS]), 백신 항원 및 시스템의 안정성(고속 원심분리기 테스트, 열역학적 안정성 테스트, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯) 및 특정 면역 반응(IgG1, IgG2a 및 IgG2b). 이 접근법을 사용하여 연구자들은 치명적인 MRSA252 마우스 모델에서 새로운 나노 에멀젼 보조 백신의 보호 효과를 정확하게 평가할 수 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 효과적인 보조제 잠재력 측면에서 가장 유망한 나노에멀젼 백신 보조제를 확인할 수 있습니다. 또한 이 방법은 향후 개발을 위해 새로운 백신을 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
메티실린 내성 황색포도 상구균 (MRSA)은 전 세계 중환자실(ICU) 병동1, 심장내과 및 화상 부서에서 감염률이 가장 높은 기회 병원체 중 하나입니다. MRSA는 높은 감염률, 사망률 및 광범위한 약물 내성을 나타내어 임상 치료에 큰 어려움을 나타냅니다2. 2017년 세계보건기구(WHO)가 발표한 항생제 내성 박테리아의 글로벌 우선순위 목록에서 MRSA는 가장 중요한 범주3에 포함되었습니다. 따라서 MRSA 감염에 대한 백신이 시급히 필요합니다.
알루미늄 보조제는 오랫동안 사용되어 왔으며 보조제 보조 메커니즘은 비교적 명확하고 안전하며 효과적이며 내약성이 우수합니다4. 알루미늄 보조제는 현재 널리 사용되는 보조제 유형입니다. 일반적으로 알루미늄염 입자에 흡착된 항원은 안정성을 향상시키고 주사 부위의 항원 흡수 능력을 향상시켜 우수한 흡수와 느린 방출을 제공할 수 있다고 믿어진다5. 현재, 알루미늄 보조제의 주요 단점은 일부 백신 후보 항원에 대해 보조제 효과가 없거나 약한 보조제 효과만을 나타낸다는 것이다6. 또한, 알루미늄 보조제는 IgE 매개 과민 반응을 유도한다5. 따라서 더 강한 면역 반응을 자극하기 위해 새로운 보조제를 개발할 필요가 있습니다.
나노에멀젼 보조제는 오일, 물, 계면활성제 및 공계면활성제로 구성된 콜로이드 분산 시스템이다7. 또한, 보조제는 열역학적으로 안정하고 등방성이며, 고속 원심분리에 의해 오토클레이브 또는 안정화될 수 있고, 온화한 제조 조건 하에서 자발적으로 형성될 수 있다. 여러 에멀젼 보조제(예: MF59, NB001-002 시리즈, AS01-04 시리즈 등)가 현재 시판 중이거나 임상 연구 단계에 있지만 입자 크기는 160nm8보다 큽니다. 따라서 나노 스케일 (1-100 nm) 의약품의 장점 (즉, 큰 비 표면적, 작은 입자 크기, 표면 효과, 높은 표면 에너지, 작은 크기 효과 및 매크로 양자 터널링 효과)을 완전히 활용할 수 없습니다. 본 프로토콜에서, 직경 크기가 1-100 nm인 나노에멀젼 기술에 기초한 신규한 보조제는 양호한 보조제 활성을 나타내는 것으로 보고되었다9. 재조합 서브유닛 백신 항원 단백질 HI (α-hemolysin 돌연변이체[Hla] 및 Fe 이온 표면 결정 인자 B[IsdB] 서브유닛 N2 활성 단편 융합 단백질)를 시험하였다. 마우스 전신 감염 모델을 사용하여 물리적 특성과 안정성을 검사하고, 근육 투여 후 특정 항체 반응을 평가하고, 백신의 보호 효과를 테스트하기 위한 일련의 절차가 수립되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
박테리아 세포벽 고정 및 철 조절 표면 단백질인 IsdB는 헴철15를 얻는 과정에서 중요한 역할을 합니다. 알파 독소인 HLA는 MRSA에서 알려진 가장 효과적인 박테리아 독소 중 하나이며, 진핵 세포에 기공을 형성하고 부착 및 상피 세포를 방해할 수 있다16. 본 연구에서는 IsdB와 Hla의 항원 유전자를 기반으로 한 유전자 공학 기술로 새로운 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 No. 2021YFC2302603, NSFC No. 32070924 및 32000651, 충칭 자연 과학 재단 프로젝트 프로그램의 No. 2019jcyjA-msxmx0159의 지원을 받았습니다.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O’Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. . Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
- Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
