Polymerase-Kettenreaktion und Dot-Blot-Hybridisierung zum Nachweis von Leptospiren in Wasserproben

Summary

In dieser Studie wurde eine Dot-Blot-Anwendung entwickelt, um Leptospira aus den drei Hauptkladen in Wasserproben nachzuweisen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung minimaler DNA-Mengen, die spezifisch auf eine Digoxigenin-markierte Sonde abzielen und von einem Anti-Digoxigenin-Antikörper leicht nachgewiesen werden können. Dieser Ansatz ist ein wertvolles und zufriedenstellendes Instrument für Screening-Zwecke.

Abstract

Der Dot-Blot ist eine einfache, schnelle, empfindliche und vielseitige Technik, die die Identifizierung minimaler DNA-Mengen ermöglicht, die spezifisch durch Sondenhybridisierung in Gegenwart von Träger-DNA anvisiert werden. Es basiert auf der Übertragung einer bekannten Menge an DNA auf einen inerten festen Träger, wie z. B. eine Nylonmembran, unter Verwendung der Dot-Blot-Apparatur und ohne elektrophoretische Trennung. Nylonmembranen haben den Vorteil einer hohen Nukleinsäurebindungskapazität (400 μg/^cm2), einer hohen Festigkeit und sind positiv oder neutral geladen. Bei der verwendeten Sonde handelt es sich um ein hochspezifisches ssDNA-Fragment von 18 bis 20 Basen mit einer Länge, das mit Digoxigenin (DIG) markiert ist. Die Sonde wird mit der Leptospira-DNA konjugieren. Sobald die Sonde mit der Ziel-DNA hybridisiert ist, wird sie von einem Anti-Digoxigenin-Antikörper detektiert, was einen einfachen Nachweis durch ihre Emissionen ermöglicht, die in einem Röntgenfilm sichtbar sind. Die Punkte mit einer Emission entsprechen den interessierenden DNA-Fragmenten. Bei dieser Methode wird die nicht-isotopische Markierung der Sonde verwendet, die eine sehr lange Halbwertszeit haben kann. Der Nachteil dieser Standard-Immunmarkierung ist eine geringere Empfindlichkeit als Isotopensonden. Dennoch wird sie durch die Kopplung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Dot-Blot-Assays gemildert. Dieser Ansatz ermöglicht die Anreicherung der Zielsequenz und deren Detektion. Darüber hinaus kann es als quantitative Anwendung im Vergleich zu einer seriellen Verdünnung eines bekannten Standards verwendet werden. Eine Dot-Blot-Anwendung zum Nachweis von Leptospira aus den drei Hauptkladen in Wasserproben wird hier vorgestellt. Diese Methode kann auf große Wassermengen angewendet werden, sobald sie durch Zentrifugation konzentriert wurden, um den Nachweis des Vorhandenseins von leptospiraler DNA zu erbringen. Dies ist ein wertvolles und zufriedenstellendes Instrument für allgemeine Screening-Zwecke und kann für andere nicht kultivierbare Bakterien verwendet werden, die im Wasser vorhanden sein können, um das Verständnis des Ökosystems zu verbessern.

Introduction

Die Leptospirose beim Menschen hat hauptsächlich ihren Ursprung in der Umwelt ^1,2. Das Vorkommen von Leptospira in Seen, Flüssen und Bächen ist ein Indikator für die Übertragung von Leptospirose unter Wildtieren sowie Haus- und Nutztieren, die schließlich mit diesen Gewässern in Kontakt kommen können ^1,3,4. Darüber hinaus wurde Leptospira in nicht-natürlichen Quellen wie Abwasser, stehendem Wasser und Leitungswasser nachgewiesen ^5,6.

Leptospira ist ein weltweit verbreitetes Bakterium ^7,8, und die Rolle der Umwelt bei ihrer Erhaltung und Übertragung ist allgemein anerkannt. Leptospira kann im Trinkwasser bei variablem pH-Wert und unterschiedlichen Mineralien^{überleben 9} und in natürlichen Gewässern¹. Es kann auch über lange Zeiträume in destilliertem Wasser^{überleben 10}, und bei konstantem pH-Wert (7,8) kann es bis zu 152 Tage überleben¹¹. Darüber hinaus können Leptospiren in bakteriellen Konsortien interagieren, um unter rauen Bedingungen zu überleben^12,13. Es kann Teil von Biofilmen im Süßwasser mit Azospirillum und Sphingomonas sein und ist sogar in der Lage, zu wachsen und Temperaturen von über 49 °C zu ertragen^14,15. Sie kann sich auch in durchnässten Böden vermehren und bis zu 379 Tage lang lebensfähig bleiben¹⁶, wobei ihre Fähigkeit, die Krankheit zu verursachen, bis zu einem Jahr lang erhalten bleibt^17,18. Über die Ökologie in Gewässern und deren Verteilung in den Gewässern ist jedoch nur wenig bekannt.

Seit ihrer Entdeckung basierte die Erforschung der Gattung Leptospira auf serologischen Untersuchungen. Erst in diesem Jahrhundert wurden molekulare Techniken bei der Erforschung dieser Spirochäten immer häufiger eingesetzt. Der Dot-Blot wurde bisher kaum für seine Identifizierung verwendet, wobei (1) eine Isotopensonde auf der Basis der 16S rRNA und ein Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)^19,20, (2) als Nanogold-basierter Immunoassay für humane Leptospirose, der auf Urin angewendet wurde²¹, oder (3) als Antikörper-basierter Assay für Rinderurinproben^{verwendet wurde 22}. Die Technik geriet in Vergessenheit, da sie ursprünglich auf Isotopensonden basierte. Es handelt sich jedoch um eine bekannte Technik, die in Verbindung mit der PCR verbesserte Ergebnisse liefert und aufgrund der Verwendung von nicht-isotopischen Sonden als sicher gilt. Die PCR spielt eine entscheidende Rolle bei der Anreicherung der Leptospira-DNA, indem ein spezifisches DNA-Fragment amplifiziert wird, das in Spuren in einer Probe vorkommen kann. Während jedes PCR-Zyklus wird die Menge des Ziel-DNA-Fragments in der Reaktion verdoppelt. Am Ende der Reaktion wurde das Amplikon mit dem Faktor von mehr als einer Million^{multipliziert 23}. Das durch PCR amplifizierte Produkt, das in der Agaroseelektrophorese oft nicht sichtbar ist, wird durch spezifische Hybridisierung mit einer DIG-markierten Sonde im Dot-Blot 24,25,26 sichtbar.

Die Dot-Blot-Technik ist einfach, robust und für zahlreiche Proben geeignet, so dass sie auch für Labore mit begrenzten Ressourcen zugänglich ist. Es wurde in einer Vielzahl von Bakterienstudien eingesetzt, einschließlich (1) oraler Bakterien²⁷, (2) anderer Probentypen wie Lebensmittel und Kot²⁸ und (3) der Identifizierung von nicht kultivierbaren Bakterien²⁹, oft in Übereinstimmung mit anderen molekularen Techniken. Zu den Vorteilen der Dot-Blot-Technik gehören: (1) Die Membran hat eine hohe Bindungskapazität und kann über 200 μg/^cm2 Nukleinsäuren und bis zu 400 μg/^cm2 binden; (2) Dot-Blot-Ergebnisse können visuell interpretiert werden, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind, und (3) sie können bequem jahrelang bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.

Die Gattung Leptospira wurde in pathogene, intermediäre und saprophytische Kladen eingeteilt ^30,31. Die Unterscheidung zwischen diesen Kladen kann anhand spezifischer Gene wie lipL41, lipL32 und der 16S rRNA erreicht werden. LipL32 ist in den pathogenen Kladen vorhanden und zeigt eine hohe Sensitivität in verschiedenen serologischen und molekularen Werkzeugen, während es in Saprophytenspezies²¹ nicht vorhanden ist. Das Housekeeping-Gen lipL41 ist für seine stabile Expression bekannt und wird in molekularen Verfahren³² verwendet, während das16 S rRNA-Gen für ihre Klassifizierung verwendet wird.

Diese Methode kann auf große Wassermengen angewendet werden, sobald sie durch Zentrifugation konzentriert wurden. Es ermöglicht die Beurteilung verschiedener Punkte und Tiefen innerhalb eines Gewässers, um das Vorhandensein von leptospiraliger DNA und der Klade, zu der sie gehört, nachzuweisen. Dieses Instrument ist sowohl für ökologische als auch für allgemeine Screening-Zwecke wertvoll und kann auch zum Nachweis anderer nicht kultivierbarer Bakterien eingesetzt werden, die möglicherweise im Wasser vorhanden sind.

Darüber hinaus sind PCR- und Dot-Blot-Assays für eine Vielzahl von Laboren technisch und wirtschaftlich erschwinglich, selbst für solche, die nicht über hochentwickelte oder teure Geräte verfügen. Ziel dieser Studie ist es, den Digoxigenin-basierten Dot-Blot zur Identifizierung der drei Leptospira-Kladen in Wasserproben einzusetzen, die aus natürlichen Gewässern entnommen wurden.

Bakterienstämme
Zwölf Leptospira-Serovare (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi und Wolffi) wurden in diese Studie eingeschlossen. Diese Serovare sind Teil der Sammlung der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie der Fakultät für Veterinärmedizin und Tierzucht der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko und werden derzeit im Mikroagglutinationstest (MAT) verwendet.

Alle Leptospira-Serovare wurden in EMJH kultiviert, und ihre DNA wurde mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit extrahiert (siehe Materialtabelle). Ein genomischer DNA-Mix der zwölf Serovare wurde als Positivkontrolle für die pathogene Leptospira-Klade verwendet. Als Positivkontrolle der Leptospira-Intermediärklade wurde die genomische DNA von Leptospira fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 eingeschlossen, und als Positivkontrolle für die Leptospira Saprophytenklade wurde auch die genomische DNA von Leptospira biflexa serovar Patoc Stamm Patoc I eingeschlossen.

Die Negativkontrollen bestanden aus einem leeren Plasmid, DNA von nicht verwandten Bakterien (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii und Escherichia coli) und Wasser in PCR-Qualität, das als Nicht-Template-Kontrolle diente.

Wasserproben
Zwölf Versuchsproben wurden unter Verwendung einer geschichtet-zufälligen Probenahmemethode vom Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16′ 54″ N 99° 6′ 11″ W) entnommen. Diese Proben wurden in drei Tiefen entnommen: oberflächlich, 10 und 30 cm (Abbildung 1A, B). Die Wasserentnahmeverfahren hatten keine Auswirkungen auf gefährdete oder geschützte Arten. Jede Probe wurde in einem sterilen 15-ml-Mikrozentrifugenröhrchen entnommen. Um die Probe zu entnehmen, wurde jedes Röhrchen vorsichtig in das Wasser getaucht, in der gewählten Tiefe gefüllt und dann verschlossen. Die Proben wurden bei 22 °C gehalten und umgehend zur Verarbeitung ins Labor transportiert.

Jede Probe wurde durch Zentrifugation in sterilen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei 8000 x g für 20 min bei Raumtemperatur konzentriert. Dieser Schritt wurde wiederholt, bis alle Proben in einem Röhrchen konzentriert waren, das dann für die DNA-Extraktion verwendet wurde (Abbildung 1C).

Abbildung 1: Konzentration der Wasserproben durch Zentrifugation. (A) Wasserprobenteiche und (B) Natürliche Bäche. (C) Zentrifugationsbasierte Verarbeitung von Wasserproben in wiederholten Schritten so oft wie nötig (n). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DNA-Extraktion
Die Gesamt-DNA wurde mit einem handelsüblichen genomischen DNA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert (siehe Materialtabelle). DNA-Extraktionen wurden in 20 μl Elutionspuffer eluiert, und die DNA-Konzentration wurde mit einem UV-Spektrophotometer bei 260-280 nm bestimmt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

PCR-Amplifikation
Die PCR-Ziele waren die 16Gene S rRNA, lipL41 und lipL32, die DNA der Gattung Leptospira identifizieren und die Unterscheidung zwischen den drei Kladen pathogen, saprophytisch und intermediär ermöglichen. Sowohl die Primer als auch die Sondendesigns basierten auf den früheren Arbeiten von Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. und Branger et al.33,34,35,36,37. Die Sequenz jeder Sonde, jedes Primers und jedes amplifizierten Fragments ist in Tabelle 1 beschrieben, und ihre Ausrichtung mit den Referenzsequenzen ist in der Zusatzdatei 1, der Zusatzdatei 2, der Zusatzdatei 3, der Zusatzdatei 4 und der Zusatzdatei 5 angegeben. Die PCR-Reagenzien und Thermocycling-Bedingungen werden im Abschnitt Protokoll beschrieben.

Die Amplifikationsprodukte wurden durch elektrophoretische Trennung an einem 1%igen Agarosegel in TAE (40 mM Trisbase, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA; pH 8,3) bei 60 V für 45 min mit Ethidium-Bromid-Detektion visualisiert, wie in der ergänzenden Abbildung 1 gezeigt. Genomische DNA, die aus jedem Serovar gewonnen wurde, wurde mit Konzentrationen von 6 x 10⁶ bis 1 x 10⁴ genomischen Äquivalentkopien (GEq) in jeder PCR-Reaktion verwendet, basierend auf der Genomgröße von L. interrogans (4, 691, 184 bp)³⁸ für pathogene Leptospira, der Genomgröße von L. biflexa (3, 956, 088 bp)³⁹ für saprophytische Leptospira, und die Genomgröße des L . fainei Serovars Hurstbridge Stamm BUT6 (4, 267, 324 bp) mit der Zugangsnummer AKWZ00000000.2.

Die Sensitivität der Sonden wurde in jedem Experiment mit DNA aus jedem pathogenen Serovar, dem L . biflexa Serovar Patoc Stamm Patoc I und dem L. fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 bewertet. Um die Spezifität des PCR- und Dot-Blot-Hybridisierungsassays zu beurteilen, wurde DNA von nicht verwandten Bakterien einbezogen.

Tabelle 1: PCR-Primer und -Sonden zur Amplifikation von Produkten zur Identifizierung der pathogenen, Saprophyten- und intermediären Kladen von Leptospira. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Dot-Blot-Hybridisierungs-Assay
Die Technik wird als Dot-Blot bezeichnet, da die Löcher, in die die DNA-Probe gelegt wird, eine Punktform haben, und wenn sie angesaugt werden, um durch Vakuumsaugen fixiert zu werden, erhalten sie diese Form. Diese Technik wurde von Kafatos et ^al.40 entwickelt. Die Technik ermöglicht die Semi-Quantifizierung von Leptospiren in jeder PCR-positiven Probe. Das Protokoll besteht aus einer Denaturierung mit NaOH 0,4 M bei Raumtemperatur, Proben mit Leptospira-DNA von 30 ng bis 0,05 ng, entsprechend 6 x 10⁶ bis 1 x 10⁴ Leptospiren, werden mit einem 96-Well-Dot-Blot-Gerät auf eine Nylonmembran blott. Nach der Immobilisierung wird die DNA durch Einwirkung von 120 mJ UV-Licht an die Membran gebunden. Jede DNA-Sonde wird durch einen terminalen Transferase-Katalyseschritt am 3′-Ende mit Digoxigenin-11 dUTP konjugiert (Digoxigenin ist ein pflanzliches Steroid, das aus Digitalis purpurea gewonnen wird und als Reporter⁴¹ verwendet wird). Nach der stringenten Hybridisierung der markierten DNA-Sonde (50 pmol) bei der spezifischen Temperatur auf die Ziel-DNA werden die DNA-Hybride durch die Chemilumineszenzreaktion mit dem anti-Digoxigenin-alkalischen Phosphatase-Antikörper, der kovalent mit seinem Substrat CSPD konjugiert ist, sichtbar gemacht. Die Lumineszenz wird durch Belichtung mit einem Röntgenfilm erfasst (Abbildung 2).

Abbildung 2: Schritte des Ablaufs für den PCR-Dot-Blot-Assay. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Vorbereitung der Probe Jede Wasserprobe wird in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C konzentriert. Wiederholen Sie diesen Schritt so oft wie nötig, um die Probe auf ein Volumen von 250 μl zu konzentrieren. Verwenden Sie das DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Führen Sie die spezifische PCR entsprechend der zu verwendenden Dot-Blot-Sonde durch …

Representative Results

Um die Wirksamkeit der Technik zu bewerten, wurde genomische DNA aus Reinkulturen jedes Leptospira-Serovars zusammen mit der kladespezifischen Sonde verwendet. Die Membranen wurden mit 100 ng genomischer DNA pro PCR-Reaktion für jedes Serovar hergestellt, gefolgt von acht genomischen DNA-Partikeln von nicht verwandten Bakterien und variablen Konzentrationen genomischer DNA der Ad-hoc-Leptospira-Serovare. Jeder Assay umfasste Positiv-, Negativ- und Nicht-Template-Kontrollen. Diese nicht verwandte genomi…

Discussion

Zu den kritischen Schritten der Dot-Blot-Technik gehören (1) DNA-Immobilisierung, (2) Blockierung der freien Bindungsstellen auf der Membran mit nicht-homologer DNA, (3) die Komplementarität zwischen der Sonde und dem Zielfragment unter Annealing-Bedingungen, (4) die Entfernung der nicht hybridisierten Sonde und (5) der Nachweis des Reportermoleküls⁴¹.

Der PCR-Dot-Blot weist bestimmte Einschränkungen auf, wie z.B. dass die Technik keine Informationen über die Grö?…

Materials

REAGENTS
Purelink DNA extraction kit	Invitrogen	K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)	Promega	M3001
Whatman filter paper, grade 1,	Merk	WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m	Roche	11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody	Roche	11093274910
Medium Base EMJH	Difco	S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH	Difco	BD 279510
Blocking Reagent	Roche	11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate	Merk	11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma Aldrich	D3159
Developer Carestream	Carestream Health Inc	GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP	Roche	11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)	Promega	H5032
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F8016
Fixer Carestream	Carestream Health Inc	GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa	Sigma Aldrich	L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa	Sigma Aldrich	L-9150	It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)	Sigma Aldrich	PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)	Sigma Aldrich	9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Terminal transferase, recombinant	Roche	3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)	Sigma-Aldrich	1185-53-1
SSPE 20X	Sigma-Aldrich	S2015-1L	It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Probes	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer	Thermo-Scientific	ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm	Sigma-Aldrich	1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl	Gilson	SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl	Axygen	T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl	Axygen	TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot	BIORAD	1706545
Portable Hergom Suction	Hergom	7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)	Hoefer	PH90-115V
UV Crosslinker	Hoefer	UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler	Hybaid	HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17	Fuji