Reacción en cadena de la polimerasa e hibridación dot-blot para la detección de leptospira en muestras de agua

Summary

En este estudio, se diseñó una aplicación de mancha de puntos para detectar Leptospira de los tres clados principales en muestras de agua. Este método permite la identificación de cantidades mínimas de ADN específicamente dirigidas por una sonda marcada con digoxigenina, fácilmente detectables por un anticuerpo anti-digoxigenina. Este enfoque es una herramienta valiosa y satisfactoria para fines de detección.

Abstract

El dot-blot es una técnica sencilla, rápida, sensible y versátil que permite la identificación de cantidades mínimas de ADN específicamente objetivo de la hibridación de sonda en presencia de ADN portador. Se basa en la transferencia de una cantidad conocida de ADN a un soporte sólido inerte, como una membrana de nailon, utilizando el aparato de mancha y sin separación electroforética. Las membranas de nailon tienen la ventaja de una alta capacidad de unión a ácidos nucleicos (400 μg / cm²), alta resistencia y están cargadas positiva o neutramente. La sonda utilizada es un fragmento de ssDNA altamente específico de 18 a 20 bases de largo marcadas con digoxigenina (DIG). La sonda se conjugará con el ADN de Leptospira . Una vez que la sonda se ha hibridado con el ADN objetivo, es detectada por un anticuerpo anti-digoxigenina, lo que permite su fácil detección a través de sus emisiones reveladas en una película de rayos X. Los puntos con una emisión corresponderán a los fragmentos de ADN de interés. Este método emplea el marcaje no isotópico de la sonda, que puede tener una vida media muy larga. El inconveniente de este marcador inmunológico estándar es una menor sensibilidad que las sondas isotópicas. Sin embargo, se mitiga mediante el acoplamiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los ensayos de dot-blot. Este enfoque permite el enriquecimiento de la secuencia objetivo y su detección. Además, se puede utilizar como una aplicación cuantitativa cuando se compara con una dilución en serie de un patrón conocido. Aquí se presenta una aplicación de mancha de puntos para detectar Leptospira de los tres clados principales en muestras de agua. Esta metodología se puede aplicar a grandes cantidades de agua una vez que se han concentrado por centrifugación para proporcionar evidencia de la presencia de ADN de Leptospiral. Se trata de una herramienta valiosa y satisfactoria para fines generales de cribado, y puede utilizarse para otras bacterias no cultivables que puedan estar presentes en el agua, mejorando la comprensión del ecosistema.

Introduction

La leptospirosis en humanos se origina principalmente en fuentes ambientales ^1,2. La presencia de Leptospira en lagos, ríos y arroyos es un indicador de transmisión de leptospirosis entre la fauna silvestre y los animales domésticos y de producción que eventualmente pueden entrar en contacto con estos cuerpos de agua ^1,3,4. Además, se ha identificado Leptospira en fuentes no naturales, como aguas residuales, estancadas y del grifo ^5,6.

Leptospira es una bacteria distribuida en todo el mundo ^7,8, y el papel del medio ambiente en su preservación y transmisión ha sido bien reconocido. Leptospira puede sobrevivir en agua potable bajo pH variable y minerales⁹, y en cuerpos de agua naturales¹. También puede sobrevivir por largos períodos en agua destilada¹⁰, y bajo pH constante (7.8), puede sobrevivir hasta 152 días¹¹. Además, Leptospira puede interactuar en consorcios bacterianos para sobrevivir a condiciones adversas^12,13. Puede formar parte de biofilms en agua dulce con Azospirillum y Sphingomonas e incluso es capaz de crecer y soportar temperaturas superiores a los 49 °C^14,15. También puede multiplicarse en suelos anegados y permanecer viable hasta 379 días¹⁶, conservando su capacidad de causar la enfermedad hasta por un año^17,18. Sin embargo, se sabe poco sobre la ecología dentro de los cuerpos de agua y cómo se distribuye dentro de ellos.

Desde su descubrimiento, el estudio del género Leptospira se basó en pruebas serológicas. No fue hasta el siglo actual cuando las técnicas moleculares se generalizaron en el estudio de esta espiroqueta. El dot-blot ha sido escasamente utilizado para su identificación utilizando (1) una sonda isotópica basada en el ARNr 16S y en una repetición de secuencia inter-simple (ISSR)^19,20, (2) como un inmunoensayo basado en nanooro para la leptospirosis humana aplicada a la orina²¹, o (3) como un ensayo basado en anticuerpos para muestras de orina bovina²². La técnica cayó en desuso porque originalmente se basaba en sondas isotópicas. Sin embargo, es una técnica bien conocida que, junto con la PCR, produce mejores resultados, y se considera segura debido al uso de sondas no isotópicas. La PCR desempeña un papel crucial en el enriquecimiento del ADN de Leptospira al amplificar un fragmento de ADN específico que se puede encontrar en trazas en una muestra. Durante cada ciclo de PCR, la cantidad del fragmento de ADN objetivo se duplica en la reacción. Al final de la reacción, el amplicón se ha multiplicado por un factor de más de un millón²³. El producto amplificado por PCR, a menudo no visible en la electroforesis de agarosa, se hace visible a través de la hibridación específica con una sonda marcada con DIG en el dot-blot 24,25,26.

La técnica de dot-blot es sencilla, robusta y adecuada para numerosas muestras, lo que la hace accesible a laboratorios con recursos limitados. Se ha empleado en una variedad de estudios de bacterias, incluyendo (1) bacterias orales²⁷, (2) otros tipos de muestras como alimentos y heces²⁸, y (3) la identificación de bacterias no cultivables²⁹, a menudo de acuerdo con otras técnicas moleculares. Entre las ventajas que ofrece la técnica de dot-blot se encuentran: (1) La membrana tiene una alta capacidad de unión, capaz de unir más de 200 μg/^cm2 de ácidos nucleicos y hasta 400 μg/^cm2; (2) Los resultados de la mancha se pueden interpretar visualmente sin necesidad de equipo especial, y (3) se pueden almacenar convenientemente durante años a temperatura ambiente (RT).

El género Leptospira ha sido clasificado en clados patógenos, intermedios y saprófitos^30,31. La distinción entre estos clados se puede lograr en función de genes específicos como lipL41, lipL32 y el ARNr 16S. LipL32 está presente en los clados patógenos y exhibe una alta sensibilidad en diversas herramientas serológicas y moleculares, mientras que está ausente en las especies de saprófitos²¹. El gen de mantenimiento lipL41 es conocido por su expresión estable y se utiliza en técnicas moleculares³², mientras que el gen 16S rRNA se utiliza para su clasificación.

Esta metodología se puede aplicar a grandes volúmenes de agua una vez que se han concentrado por centrifugación. Permite la evaluación de diversos puntos y profundidades dentro de un cuerpo de agua para detectar la presencia de ADN leptoespiral y el clado al que pertenece. Esta herramienta es valiosa tanto para fines ecológicos como para fines generales de detección y también se puede emplear para detectar otras bacterias no cultivables que pueden estar presentes en el agua.

Además, los ensayos de PCR y dot-blot son técnica y económicamente asequibles para una amplia gama de laboratorios, incluso para aquellos que carecen de equipos sofisticados o costosos. Este estudio tiene como objetivo aplicar el dot-blot basado en digoxigenina para la identificación de los tres clados de Leptospira en muestras de agua recolectadas de cuerpos de agua naturales.

Cepas bacterianas
Se incluyeron en este estudio doce serovares de Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi y Wolffi). Estos serovares forman parte de la colección del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México, y actualmente se utilizan en el ensayo de microaglutinación (MAT).

Todos los serovares de Leptospira se cultivaron en EMJH y su ADN se extrajo utilizando un kit comercial de extracción de ADN (ver Tabla de Materiales). Se utilizó una mezcla de ADN genómico de los doce serovares como control positivo para el clado patógeno de Leptostpira . Como control positivo del clado intermedio de Leptospira , se incluyó ADN genómico de Leptospira fainei serovar cepa BUT6 de Hurstbridge, y como control positivo para el clado de saprófitos de Leptospira , también se incluyó ADN genómico de Leptospira biflexa serovar cepa Patoc Patoc I.

Los controles negativos consistieron en un plásmido vacío, ADN de bacterias no relacionadas (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii y Escherichia coli) y agua de grado PCR, que sirvió como control no molde.

Muestras de agua
Se recolectaron doce muestras de prueba utilizando un método de muestreo estratificado-aleatorio del Centro de Investigación Biológica y Acuícola de Cuemanco (CIBAC) (19° 16′ 54″ N 99° 6′ 11″ W). Estas muestras se obtuvieron a tres profundidades: superficial, 10 y 30 cm (Figura 1A, B). Los procedimientos de recolección de agua no afectaron a ninguna especie en peligro de extinción o protegida. Cada muestra se recogió en un tubo de microcentrífuga estéril de 15 mL. Para recolectar la muestra, cada tubo se sumergió suavemente en el agua, se llenó a la profundidad seleccionada y luego se selló. Las muestras se mantuvieron a 22 °C y se transportaron rápidamente al laboratorio para su procesamiento.

Cada muestra se concentró por centrifugación en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL a 8000 x g durante 20 min a temperatura ambiente. Este paso se repitió hasta que todas las muestras se concentraron en un tubo, que luego se utilizó para la extracción de ADN (Figura 1C).

Figura 1: Concentración de muestras de agua por centrifugación. (A) Estanques de muestreo de agua, y (B) Arroyos naturales. (C) Procesamiento de muestras de agua basado en centrifugación en pasos repetidos tantas veces como sea necesario (n). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Extracción de ADN
El ADN total se aisló utilizando un kit comercial de ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Las extracciones de ADN se eluyeron en 20 μL de tampón de elución, y la concentración de ADN se determinó mediante un espectrofotómetro UV a 260-280 nm, y se almacenó a 4 °C hasta su uso.

Amplificación por PCR
Los objetivos de PCR fueron los genes 16S rRNA, lipL41 y lipL32, que identifican el ADN del género Leptospira y permiten distinguir entre los tres clados: patógeno, saprófito e intermedio. Tanto los cebadores como los diseños de las sondas se basaron en los trabajos previos de Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. y Branger et al.33,34,35,36,37. La secuencia de cada sonda, cebador y fragmento amplificado se describe en la Tabla 1, y su alineación con las secuencias de referencia se proporciona en el Archivo Suplementario 1, el Archivo Suplementario 2, el Archivo Suplementario 3, el Archivo Suplementario 4 y el Archivo Suplementario 5. Los reactivos de PCR y las condiciones de termociclado se describen en la sección de protocolo.

Los productos de amplificación se visualizaron por separación electroforética en un gel de agarosa al 1% en TAE (40 mM de base Tris, 20 mM de ácido acético y 1 mM de EDTA; pH 8,3), a 60 V durante 45 min con detección de bromuro de etidio, como se muestra en la Figura suplementaria 1. El ADN genómico obtenido de cada serovar se utilizó con concentraciones que oscilaron entre 6 x 10^{6 y} 1 x 10^{4 copias} genómicas equivalentes (GEq) en cada reacción de PCR, basándose en el tamaño del genoma de L. interrogans (4, 691, 184 pb)³⁸ para Leptospira patógena, el tamaño del genoma de L. biflexa (3, 956, 088 pb)³⁹ para Leptospira saprófita, y el tamaño del genoma de L. fainei serovar Hurstbridge cepa BUT6 (4, 267, 324 pb) con número de acceso AKWZ00000000.2.

La sensibilidad de las sondas se evaluó con ADN de cada serovar patógeno, L. biflexa serovar, cepa Patoc I, y L. fainei serovar, cepa BUT6 de Hurstbridge. Para evaluar la especificidad del ensayo de PCR e hibridación dot-blot, se incluyó ADN de bacterias no relacionadas.

Tabla 1: Cebadores y sondas de PCR para amplificar productos para la identificación de los clados patógenos, saprófitos e intermedios de Leptospira. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Ensayo de hibridación dot-blot
La técnica se denomina dot-blot porque los orificios en los que se coloca la muestra de ADN tienen forma de punto, y cuando se succionan para ser fijados en su lugar por succión al vacío, adquieren esta forma. Esta técnica fue desarrollada por Kafatos et ^al.40. La técnica permite la semicuantificación de Leptospira en cada muestra PCR positiva. El protocolo consiste en una desnaturalización con NaOH 0,4 M a temperatura ambiente, muestras con ADN de Leptospira de 30 ng a 0,05 ng, correspondientes a 6 x 10⁶ a 1 x 10⁴ leptospiras, se secan en una membrana de nailon con un aparato de puntos de 96 pocillos. Después de la inmovilización, el ADN se une a la membrana mediante la exposición a 120 mJ de luz ultravioleta. Cada sonda de ADN se conjuga con digoxigenina-11 dUTP mediante una etapa de catálisis de transferasa terminal en el extremo 3′ (la digoxigenina es un esteroide vegetal obtenido de Digitalis purpurea, utilizado como reportero⁴¹). Tras la hibridación rigurosa de la sonda de ADN marcada (50 pmol) a la temperatura específica en el ADN objetivo, los híbridos de ADN se visualizan mediante la reacción de quimioluminiscencia con el anticuerpo anti-digoxigenina fosfatasa alcalina conjugado covalentemente con su sustrato CSPD. La luminiscencia se captura mediante la exposición a una película de rayos X (Figura 2).

Figura 2: Pasos del procedimiento para el ensayo PCR-dot-blot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Preparación de la muestra Concentrar cada muestra de agua en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por centrifugación a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C. Repita este paso, tantas veces como sea necesario, para concentrar la muestra en un volumen de 250 μL. Utilice el kit de extracción de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales). Realizar la PCR específica según la sonda dot-blot que se vaya a util…

Representative Results

Para evaluar la efectividad de la técnica, se utilizó ADN genómico de cultivos puros de cada Leptospira serovar, junto con la sonda específica del clado. Las membranas se prepararon con 100 ng de ADN genómico por reacción de PCR para cada serovar, seguido de ocho ADN genómico de bacterias no relacionadas y concentraciones variables de ADN genómico de los serovares ad hoc de Leptospira. Cada ensayo incluyó control positivo, negativo y no especial. Este ADN genómico no relacionado no mostró afi…

Discussion

Los pasos críticos de la técnica de dot-blot incluyen (1) la inmovilización del ADN, (2) el bloqueo de los sitios de unión libres en la membrana con ADN no homólogo, (3) la complementariedad entre la sonda y el fragmento objetivo en condiciones de recocido, (4) la eliminación de la sonda no hibridada y (5) la detección de la molécula reportera⁴¹.

El PCR-Dot-blot tiene ciertas limitaciones, como que la técnica no proporciona información sobre el tamaño del fra…

Materials

REAGENTS
Purelink DNA extraction kit	Invitrogen	K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)	Promega	M3001
Whatman filter paper, grade 1,	Merk	WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m	Roche	11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody	Roche	11093274910
Medium Base EMJH	Difco	S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH	Difco	BD 279510
Blocking Reagent	Roche	11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate	Merk	11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma Aldrich	D3159
Developer Carestream	Carestream Health Inc	GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP	Roche	11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)	Promega	H5032
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F8016
Fixer Carestream	Carestream Health Inc	GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa	Sigma Aldrich	L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa	Sigma Aldrich	L-9150	It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)	Sigma Aldrich	PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)	Sigma Aldrich	9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Terminal transferase, recombinant	Roche	3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)	Sigma-Aldrich	1185-53-1
SSPE 20X	Sigma-Aldrich	S2015-1L	It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Probes	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer	Thermo-Scientific	ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm	Sigma-Aldrich	1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl	Gilson	SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl	Axygen	T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl	Axygen	TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot	BIORAD	1706545
Portable Hergom Suction	Hergom	7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)	Hoefer	PH90-115V
UV Crosslinker	Hoefer	UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler	Hybaid	HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17	Fuji