本研究设计了一种点印迹法，用于检测水样中三个主要进化枝的Leptospira。该方法可特异性识别地高辛标记探针所靶向的极微量DNA，并通过抗地高辛抗体实现便捷检测。该技术是一种用于筛查的有效且令人满意的工具。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
点印迹（dot-blot）是一种简单、快速、灵敏且用途广泛的检测技术，可在载体DNA存在的情况下，通过探针杂交特异性地鉴定极微量的目标DNA。该技术基于将已知量的DNA直接转移至惰性固相支持物（如尼龙膜）上，使用点印迹装置完成，无需电泳分离。尼龙膜具有高核酸结合能力（400 µg/cm2）、高强度，且可带正电荷或中性电荷。所用探针为一段长度为18至20个碱基、用地高辛（DIG）标记的高度特异性单链DNA（ssDNA）片段，该探针可与Leptospira DNA发生结合。当探针与目标DNA杂交后，通过抗地高辛抗体进行检测，并在X光胶片上显示其发出的信号，从而实现简便检测。出现信号的斑点即对应所关注的DNA片段。本方法采用非同位素标记探针，其半衰期极长。这种标准免疫标记法的缺点是灵敏度低于同位素探针，但通过将聚合酶链式反应（PCR）与点印迹检测联用，可有效弥补这一不足。该联合方法可实现目标序列的富集与检测。此外，在与已知浓度标准品的系列稀释液进行比较时，该方法还可用于定量分析。本文介绍了一种用于检测水样中来自三个主要进化枝的Leptospira的点印迹应用。一旦水样通过离心浓缩，该方法即可用于大量水样的检测，以确认是否存在钩端螺旋体DNA。该技术是一种有效且可靠的通用筛查工具，也可用于检测水中其他不可培养的细菌，有助于加深对水生生态系统的理解。
引言
人类中的钩端螺旋体病主要来源于环境1,2. 存在 钩端螺旋体 在湖泊、河流和溪流中的存在是野生动物以及家养和养殖动物之间传播钩端螺旋体病的指示指标，这些动物可能最终会与这些水体接触1,3,4此外， 钩端螺旋体 已在非天然来源中发现，包括污水、静止水和自来水5,6.
Leptospira 是一种在全球范围内分布的细菌7,8，其在环境中的保存和传播作用已被广泛认识。Leptospira 可在不同 pH 和矿物质条件下存活于饮用水中9，也可存在于自然水体中1。它还能在蒸馏水中长期存活10，在恒定 pH（7.8）条件下可存活长达 152 天....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 样品制备
- 在4 °C条件下，以8,000 × g离心10分钟，将每份水样在1.5 mL微量离心管中浓缩。根据需要重复此步骤，直至样品体积浓缩至250 µL。
- 按照制造商说明书使用DNA提取试剂盒（见材料表）。
- 根据将使用的点杂交探针进行特异性PCR（表1）。
- 在PCR管中进行扩增，总体积为25 µL，包含1×缓冲液、2.5单位Taq DNA聚合酶、每种引物1 µM、每种dNTP 0.2 mM、MgCl2 1.5 mM，以及来自每份水样或参考基因组DNA的100 ng目标DNA。
- 根据热循环条件（表2）在热循环仪中设置PCR程序。
- 将反应产物储存于4 °C，待用。
- 将每份待杂交的PCR产物各取10 µL，分别加入96孔板的不同孔中。
- 向每个孔中加入40 µL TE缓冲液，并用移液器吹打混匀。
注意：96孔板可密封后在4 °C保存过夜。请参照补充文件6中的说明配制本方案所需的缓冲液和溶液。图3展示了样品制备的步骤。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为评估该技术的有效性，从每种纯培养物中提取基因组DNA 钩端螺旋体 血清型被使用，并结合了特定进化枝的探针。每种血清型的PCR反应中使用100 ng基因组DNA制备膜，随后包括八种非相关细菌的基因组DNA以及不同浓度的目标基因组DNA 临时性钩端螺旋体 血清型。每个检测均包含阳性对照、阴性对照和无模板对照。这些非相关基因组DNA未显示出对点印迹探针的亲和性。膜分布及点印迹膜结果如图所示。 补充图 2， 补充图3， 补充图4， 补充图5， 补充图6， 补充图 7关于腐生菌分支，使用DB_Saproprobe探针，针对用引物D.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
点印迹技术的关键步骤包括：(1) DNA 固定，(2) 用非同源 DNA 封闭膜上的游离结合位点，(3) 在退火条件下探针与目标片段之间的互补配对，(4) 去除未杂交的探针，以及 (5) 报告分子的检测41。
PCR点印迹法存在某些局限性，例如该技术无法提供有关杂交片段大小的信息37，在使用第二种或第三种探针重新杂交之前需要对同一膜进行去杂交处理，且获得最终结果需要耗费较多的时间和精力。
该技术与其他分子技术42,43及其应用具有一致性。反向点杂交、纳米金点杂交21和点印迹酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）42已被用于检测Treponema44、.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢 钩端螺旋体 样品的收集 墨西哥国立自治大学兽医与动物科学学院微生物学与免疫学系我们感谢慷慨捐赠的参考品 钩端螺旋体 菌株； Leptospira fainei 血清型 Hurstbridge 菌株 BUT6 和 钩端螺旋体双曲种 血清型 Patoc 菌株 Patoc I 致谢 Alejandro de la Peña Moctezuma 博士。感谢 José Antonio Ocampo Cervantes 博士、CIBAC 协调员及其团队提供的后勤支持。EDT 参与了本科学生终端项目计划 墨西哥自治都市大学-夸希马尔帕校区我们感谢使用 Biorender.com 软件绘制图 1 和图 3 至 9
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Purelink DNA 提取试剂盒 | Invitrogen | K182002 | |
| Gotaq Flexi DNA 聚合酶（终点 PCR Taq 聚合酶试剂盒） | Promega | M3001 | |
| Whatman 滤纸，1 号级 | Merk | WHA1001325 | |
| 尼龙膜，正电荷，30 cm × 3 m 卷装 | Roche | 11417240001 | |
| 抗地高辛-碱性磷酸酶，Fab 片段，羊多克隆一抗 | Roche | 11093274910 | |
| EMJH 中等基础培养基 | Difco | S1368JAA | |
| 钩端螺旋体 EMJH 增菌液 | Difco | BD 279510 | |
| 封闭试剂 | Roche | 11096176001 | |
| CSPD 即用型 二钠 3-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}8-4-基)苯基磷酸酯 | Merk | 11755633001 | |
| 鲱鱼精子来源的脱氧核糖核酸 | Sigma Aldrich | D3159 | |
| Carestream 显影剂 | Carestream Health Inc | GBX5158621 | |
| 地高辛-11-ddUTP | Roche | 11363905910 | |
| EDTA，二钠盐（二水合物） | Promega | H5032 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Carestream 定影剂 | Carestream Health Inc | GBX 5158605 | |
| 月桂基硫酸钠（十二烷基硫酸钠；SDS）C12H25O4SNa | Sigma Aldrich | L5750 | |
| N-月桂酰肌氨酸钠盐 CH3(CH2)10CON(CH3)CH2COONa | Sigma Aldrich | L-9150 | 它是一种阴离子表面活性剂 |
| 聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40） | Sigma Aldrich | PVP40 | |
| 聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯（Tween 20） | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma Aldrich | 151-21-3 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| 磷酸氢二钠（NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| 末端转移酶，重组型 | Roche | 3289869103 | |
| Tris 盐酸盐（Tris HCl） | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | 可按照补充文件 6 自行配制 |
| 引物 | Sigma-Aldrich | 按需订购 | 参见表 1 |
| 探针 | Sigma-Aldrich | 按需订购 | 参见表 1 |
| 设备 | |||
| Nanodrop™ One 分光光度计 | Thermo-Scientific | ND-ONE-W | |
| 可制冷微量离心机 Sigma 1-14K，适用于 1.5 ml 微量离心管在 14,000 rpm 条件下离心 | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
| 已消毒可调移液器，量程 2–20 µl，20–200 µl | Gilson | SKU:F167360 | |
| 一次性 1.5 ml 微量离心管（已高压灭菌） | Axygen | MCT-150-SP | |
| 一次性 600 µl 微量离心管（已高压灭菌） | Axygen | 3208 | |
| 一次性移液器吸头 1–10 µl | Axygen | T-300 | |
| 一次性移液器吸头 1–200 µl | Axygen | TR-222-Y | |
| 点印迹装置 Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
| 便携式 Hergom 抽滤泵 | Hergom | 7E-A | |
| 科学光源箱（可见光 PH90-115V） | Hoefer | PH90-115V | |
| 紫外交联仪 | Hoefer | UVC-500 | |
| Thermo Hybaid PCR Express 梯度 PCR 仪 | Hybaid | HBPX110 | |
| 带 IP 板的放射自显影暗盒，14 × 17 英寸 | Fuji |
参考文献
- Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055(2020).
- Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
