نمذجة التصلب المتعدد في الجنسين: MOG35-55-التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي الناجم عن
Summary
يعد التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي أحد أكثر نماذج الفئران استخداما على نطاق واسع لمرض التصلب المتعدد. في البروتوكول الحالي ، يتم تحصين الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين بببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين ، مما يؤدي بشكل رئيسي إلى شلل جزئي تصاعدي في الذيل والأطراف. نناقش هنا بروتوكول التعريف والتقييم EAE.
Abstract
التصلب المتعدد (MS) هو مرض التهابي مناعي ذاتي مزمن يؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS). يتميز بانتشار مختلف بين الجنسين ، مما يؤثر على النساء أكثر من الرجال ، ونتائج مختلفة ، تظهر أشكالا أكثر عدوانية لدى الرجال منها لدى النساء. علاوة على ذلك ، فإن مرض التصلب العصبي المتعدد غير متجانس للغاية من حيث الجوانب السريرية والسمات الإشعاعية والمرضية. وبالتالي ، من الضروري الاستفادة من النماذج الحيوانية التجريبية التي تسمح بالتحقيق في أكبر عدد ممكن من جوانب علم الأمراض. يمثل التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) أحد أكثر نماذج مرض التصلب العصبي المتعدد استخداما في الفئران ، حيث يقوم بنمذجة ميزات المرض المختلفة ، من تنشيط الجهاز المناعي إلى تلف الجهاز العصبي المركزي. هنا نصف بروتوكولا لتحريض EAE في كل من الفئران C57BL / 6J من الذكور والإناث باستخدام تحصين البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG35-55) ، مما يؤدي إلى تطور شكل مزمن من المرض. نبلغ أيضا عن تقييم النتيجة السريرية اليومية والأداء الحركي لهذه الفئران لمدة 28 يوما بعد التحصين (28 نقطة في البوصة). أخيرا ، نوضح بعض التحليلات النسيجية الأساسية على مستوى الجهاز العصبي المركزي ، مع التركيز على الحبل الشوكي باعتباره الموقع الرئيسي للتلف الناجم عن المرض.
Introduction
التصلب المتعدد (MS) هو مرض التهابي مناعي ذاتي مزمن يؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS). يظهر وجود تسلل حول الأوعية الدموية للخلايا الالتهابية ، وإزالة الميالين ، وفقدان المحور العصبي ، والتسمم1. لا تزال مسبباته غير معروفة ، وتشير جوانبه السريرية والتصوير الشعاعي والسمات المرضية إلى عدم تجانس ملحوظ في المرض2.
نظرا لمسببات وتعقيده غير المعروفين ، في الوقت الحاضر ، لا يوجد نموذج حيواني يلخص جميع السمات السريرية والإشعاعية المعروضة في MS 3,4 البشري. ومع ذلك ، يتم استخدام نماذج حيوانية مختلفة لدراسة جوانب مختلفة من MS 3,4. في هذه النماذج ، عادة ما يكون بدء المرض مصطنعا للغاية ، ويختلف الإطار الزمني لظهور العلامات السريرية بين البشر والفئران. على سبيل المثال ، في البشر ، لا يتم اكتشاف العمليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء المرض لسنوات قبل ظهور المظاهر السريرية. على العكس من ذلك ، يمكن للمجربين اكتشاف الأعراض في النماذج الحيوانية في غضون أسابيع أو حتى أيام بعد تحريض مرض التصلب العصبي المتعدد4.
تنتج ثلاثة نماذج حيوانية أساسية سمات إزالة الميالين التي تميز مرض التصلب العصبي المتعدد: تلك التي يسببها الفيروس (على سبيل المثال، فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفأر في ثيلر)، وتلك التي تسببها العوامل السامة (على سبيل المثال، كوبريزون، ليسوليسيثين)، والمتغيرات المختلفة لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE)5. يساعد كل نموذج في دراسة بعض الجوانب المحددة للمرض ولكن لا شيء يكرر جميع ميزات MS6. وبالتالي ، من الأهمية بمكان اختيار النموذج الصحيح مع مراعاة الاحتياجات التجريبية المحددة والأسئلة العلمية التي يجب معالجتها.
بفضل إجراءات التحصين ضد المستضدات المشتقة من المايلين ، يتم تحفيز EAE عن طريق تحفيز استجابة المناعة الذاتية لمكونات الجهاز العصبي المركزي في الفئران الحساسة. يؤدي التفاعل بين مجموعة واسعة من الآليات المناعية المرضية والعصبية المرضية إلى تطور السمات المرضية الرئيسية لمرض التصلب العصبي المتعدد (أي الالتهاب وإزالة الميالين وفقدان المحور العصبي والتسمم بالدم) في الفئران المحصنة 7,8. تبدأ الفئران في إظهار الأعراض السريرية في الأسبوع الثاني تقريبا بعد التحصين وتظهر عموما شللا تصاعديا من الذيل إلى الطرف والطرف الأمامي. يتم تقييم النتيجة السريرية (أي القياس الكمي لتراكم العجز المرتبط بالمرض) بشكل عام باستخدام مقياس مكون من 5 نقاط7.
يمكن استخدام التحصين النشط بالبروتين أو الببتيد أو النقل السلبي للخلايا التائية الدماغية المنشأ للحث على EAE في الفئران ذات الخلفيات الوراثية المختلفة (على سبيل المثال ، SJL / J ، C57BL / 6 ، والفئران غير المصابة بالسمنة والسكري (NOD). بروتين المايلين البروتيني (PLP) وبروتين الميالين الأساسي (MBP) والبروتين السكري قليل التغصن المياليني (MOG) هي أمثلة على بروتينات الجهاز العصبي المركزي الذاتي التي تنتج منها عادة مولدات المناعة. على وجه الخصوص ، تقوم الفئران SJL / J المحصنة بالخاتمة المناعية ل PLP (PLP139−151) بتطوير مسار مرض الانتكاس والتحويل (RR) ، بينما تظهر الفئران C57BL / 6J المحصنة بالببتيد MOG35-55 المناعي EAE ذو الطبيعةالمزمنة 1. على الرغم من بعض القيود ، مثل توفير القليل جدا من المعلومات حول تطور مرض التصلب العصبي المتعدد ، أو دور الخلايا البائية في المرض ، أو الآليات من الداخل إلى الخارج ، أو الصعوبات في دراسة إعادة الميالين ، فقد ساهمت نماذج EAE بشكل كبير في فهم عمليات المناعة الذاتية والالتهابات العصبية ، وزيادة المعرفة في مجال مرض التصلب العصبي المتعدد وبالتالي السماح بتطوير مناهج علاجية جديدة لهذا المرض4 ، 6.
في العمل الحالي ، ركزنا على شكل معين من EAE النشط ، وهو ببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG35-55) – الشكلالناجم عن 9،10،11،12. نماذج EAE المستحثةMOG 35-55 شكل مزمن من مرض التصلب العصبي المتعدد. بعد التحصين ، تخضع الفئران لمرحلة بدون أعراض خلال الأسبوع الأول بعد التحصين ، ثم يظهر المرض عادة خلال الأسبوع الثاني بعد التحصين ، بينما بين الأسبوعين الثالث والرابع بعد التحصين ، يصبح المرض مزمنا ، مع عدم وجود إمكانية للشفاء التام من العجز المتراكم7،8،13. ومن المثير للاهتمام ، أنه لم يتم ملاحظة أي فروق بين الذكور والإناث في الإصابة أو بداية المرض أو مساره أو تقدمه في معظم الدراسات الموجودة في الأدبيات14 ، حتى لو كانت الدراسات أقل تقارن المرض بين الذكور والإناث.
في المقابل ، في البشر ، من المعروف أن هذه المعلمات تكون ثنائية الشكل جنسيابقوة 2. يؤثر مرض التصلب العصبي المتعدد على النساء أكثر من الرجال. ومع ذلك ، فإن الرجال عموما يصابون بشكل أكثر عدوانية من المرض2. وقد اقترح هذا الدليل دورا أساسيا ومعقدا لهرمونات الغدد التناسلية15. ومع ذلك ، فإن دور وآلية عمل الهرمونات الجنسية في علم الأمراض لا يزال غير واضح. علاوة على ذلك ، تدعم البيانات من النماذج الحيوانية فكرة أن كلا من هرمون الاستروجين والأندروجينات يمارسان تأثيرات إيجابية على مساحات مختلفة من علم الأمراض بطريقة خاصة بالجنس16,17.
تشير بعض الدراسات أيضا إلى تأثيرات البروجسترون الواقية للأعصاب والبروميالين والمضادة للالتهابات18 ، وعلى الرغم من ندرة الأدلة في مرضى التصلب العصبيالمتعدد 18 ، فإن الستيرويدات العصبية النشطة (أي المنشطات المركبة من قبل الجهاز العصبي ، مثل بريجنينولوني ، رباعي هيدروبروجستيرون ، وثنائي هيدروبروجستيرون) قد تؤثر أيضا على الدورة المرضية19. بشكل جماعي ، تدعم هذه البيانات فكرة أن الهرمونات الجنسية المنتجة محيطيا وداخل الجهاز العصبي المركزي لها دور مهم وخاص بالجنس في ظهور المرض وتطوره. لذلك ، في العمل الحالي ، نحث على جمع بيانات منفصلة من كل من الذكور والإناث.
من وجهة نظر التشريح المرضي ، تعمل المادة البيضاء للحبل الشوكي كموقع رئيسي لإصابة الجهاز العصبي المركزي في هذا النموذج ، والذي يتميز بمناطق متعددة البؤر ومتقاربة من التسلل الالتهابي أحادي النواة وإزالة الميالين8. وبالتالي ، عند وصف هذا البروتوكول لتحريض EAE الناجم عن MOG35-55 في الفئران C57BL / 6J ، سنأخذ في الاعتبار نتائج المرض في الجنسين ونقدم بعض الأفكار النسيجية المرضية فيما يتعلق بالحبل الشوكي.
Protocol
Representative Results
Discussion
أدى بروتوكول EAE الناجم عن MOG35-55 الذي وصفناه إلى تطوير شكل مزمن من مرض التصلب العصبي المتعدد في الفئران C57BL / 6J7،8،13. في هذه النتائج التمثيلية ، أبلغنا أن من كلا الجنسين التي خضعت لإجراء التحصين طورت شكلا مزمنا من المرض (أي أنها لا تتعافى…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الخارجية ، وجامعة وجامعة ريسيركا – مشروع MIUR Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 و 2023-2027 إلى قسم علم الأعصاب ريتا ليفي مونتالتشيني. مؤسسة كافالييري أوتولينغي، أورباسانو، إيطاليا. كان BB زميلا في INFRA-P ، منطقة بيدمونت (n.378-35) (2022-2023) و PRIN 2020 – 20203AMKTW. نشكر مؤسسة البحوث الحيوية أونلوس (FORB) على الدعم. تم دعم رسوم النشر من خلال التبرع الكريم من Distretto Rotaract 2031 ، وعلى وجه الخصوص ، Rotaract Club Torino Nord-Est. نشكر إيلين ميلر على التدقيق اللغوي لمخطوطتنا.
Materials
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
References
- Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
- Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
- Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
- Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , (2001).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
- Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
- Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
- Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
- Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
- McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It’s complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
- Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
- Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
- Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -. C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
- Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
- Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -. G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
- Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
- vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
- Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida–a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C., Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. Chapter 16 – Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. , 308-379 (2009).
- Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
- Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
- Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
- Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
- Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
- Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund’s adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
- Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
- Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
- Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -. J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
- Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).
