JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神经科学

Modellering van multiple sclerose bij de twee geslachten: MOG35-55-geïnduceerde experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Published: October 13, 2023
doi:
10.3791/65778
, , ,
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”,University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit,University of Camerino, 4Koelliker Hospital

Summary

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis is een van de meest gebruikte muizenmodellen van multiple sclerose. In het huidige protocol worden C57BL/6J-muizen van beide geslachten geïmmuniseerd met myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide, wat voornamelijk resulteert in oplopende parese van de staart en ledematen. Hier bespreken we het protocol van EAE-inductie en -evaluatie.

Abstract

Multiple sclerose (MS) is een chronische auto-immuunziekte die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantast. Het wordt gekenmerkt door een verschillende prevalentie bij de geslachten, die meer vrouwen dan mannen treft, en verschillende uitkomsten, met agressievere vormen bij mannen dan bij vrouwen. Bovendien is MS zeer heterogeen in termen van klinische aspecten, radiologische en pathologische kenmerken. Het is dus noodzakelijk om gebruik te maken van experimentele diermodellen die het mogelijk maken om zoveel mogelijk aspecten van de pathologie te onderzoeken. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) vertegenwoordigt een van de meest gebruikte modellen van MS bij muizen, waarbij verschillende ziektekenmerken worden gemodelleerd, van de activering van het immuunsysteem tot schade aan het CZS. Hier beschrijven we een protocol voor de inductie van EAE in zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL/6J-muizen met behulp van myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55) immunisatie, wat leidt tot de ontwikkeling van een chronische vorm van de ziekte. We rapporteren ook de evaluatie van de dagelijkse klinische score en motorische prestaties van deze muizen gedurende 28 dagen na immunisatie (28 dpi). Ten slotte illustreren we enkele fundamentele histologische analyses op het niveau van het CZS, met de nadruk op het ruggenmerg als de primaire plaats van door de ziekte veroorzaakte schade.

Introduction

Multiple sclerose (MS) is een chronische auto-immuunziekte die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantast. Het toont de aanwezigheid van perivasculaire infiltratie van ontstekingscellen, demyelinisatie, axonaal verlies en gliose1. De etiologie ervan blijft onbekend, en de klinische aspecten, radiografische en pathologische kenmerken suggereren een opmerkelijke heterogeniteit in de ziekte.

Vanwege de onbekende etiologie en complexiteit is er op dit moment geen enkel diermodel dat alle klinische en radiologische kenmerken recapituleert die worden vertoond bij menselijke MS 3,4. Er worden echter verschillende diermodellen gebruikt om verschillende aspecten van MS 3,4 te bestuderen. In deze modellen is het ontstaan van de ziekte doorgaans extreem kunstmatig en verschilt het tijdsbestek van het begin van klinische symptomen tussen mensen en muizen. Bij mensen zijn de pathofysiologische processen die ten grondslag liggen aan de ziekte bijvoorbeeld jarenlang onopgemerkt gebleven vóór het begin van klinische manifestaties. Omgekeerd kunnen de onderzoekers symptomen in diermodellen detecteren binnen enkele weken of zelfs dagen na MS-inductie4.

Drie basisdiermodellen produceren de kenmerken van demyelinisatie die kenmerkend zijn voor MS: modellen die door het virus worden geïnduceerd (bijv. Theiler’s muizenencefalomyelitisvirus), modellen die worden geïnduceerd door toxische stoffen (bijv. cuprizon, lysolecithine) en de verschillende varianten van experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE)5. Elk model helpt bij het bestuderen van enkele specifieke facetten van de ziekte, maar geen enkel model repliceert alle kenmerken van MS6. Het is dus van cruciaal belang om het juiste model te kiezen, rekening houdend met de specifieke experimentele behoeften en de wetenschappelijke vragen die moeten worden beantwoord.

Dankzij immunisatieprocedures tegen myeline-afgeleide antigenen wordt EAE geïnduceerd door een auto-immuunrespons op CZS-componenten bij gevoelige muizen op te wekken. De wisselwerking tussen een breed scala aan immunopathologische en neuropathologische mechanismen veroorzaakt de ontwikkeling van de belangrijkste pathologische kenmerken van MS (d.w.z. ontsteking, demyelinisatie, axonaal verlies en gliose) bij de geïmmuniseerde muizen 7,8. Muizen beginnen klinische symptomen te vertonen rond de tweede week na immunisatie en vertonen over het algemeen oplopende verlamming van de staart tot de ledemaat en voorpoot. De klinische score (d.w.z. kwantificering van de accumulatie van ziektegerelateerde tekorten) wordt over het algemeen beoordeeld met behulp van een 5-puntsschaal7.

Actieve immunisatie met eiwit of peptide of passieve overdracht van encefalitogene T-cellen kan worden gebruikt om EAE te induceren bij muizen met verschillende genetische achtergronden (bijv. SJL/J, C57BL/6 en niet-zwaarlijvig-diabetische (NOD) muizen). Myeline-proteolipide-eiwit (PLP), myeline-basisch eiwit (MBP) en myeline-oligodendrocytglycoproteïne (MOG) zijn voorbeelden van zelf-CZS-eiwitten waaruit gewoonlijk immunogenen worden geproduceerd. Met name SJL/J-muizen geïmmuniseerd met het immunodominante epitoop van PLP (PLP139−151) ontwikkelen een relapsing-remitting (RR) ziekteverloop, terwijl C57BL/6J-muizen geïmmuniseerd met het immunodominante MOG35-55-peptide EAE vanchronische aard vertonen1. Ondanks enkele beperkingen, zoals het verstrekken van zeer weinig informatie over de progressie van MS, de rol van B-cellen in de ziekte, de inside-out-mechanismen of moeilijkheden bij het bestuderen van remyelinisatie, hebben de EAE-modellen enorm bijgedragen aan het begrip van auto-immuun- en neuro-inflammatoire processen, waardoor de kennis op het gebied van MS is toegenomen en zo de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen voor deze ziekte mogelijk is geworden. 6. okt.

In het huidige werk hebben we ons gericht op een bepaalde vorm van actieve EAE, de myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55)-geïnduceerde vorm 9,10,11,12. De MOG35-55-geïnduceerde EAE modelleert een chronische vorm van MS. Na immunisatie ondergaan de muizen een asymptomatische fase binnen de eerste week na immunisatie, waarna de ziekte meestal optreedt tijdens de tweede week na immunisatie, terwijl tussen de derde en vierde week na immunisatie de ziekte chronisch wordt, zonder mogelijkheid tot volledig herstel van de geaccumuleerde tekorten 7,8,13. Interessant is dat er geen verschillen tussen mannen en vrouwen worden waargenomen in incidentie, begin van de ziekte, verloop of progressie in de meeste onderzoeken die in de literatuur aanwezigzijn14, ook al vergelijken minder onderzoeken de ziekte bij mannen en vrouwen.

Bij mensen daarentegen is bekend dat deze parameters sterk seksueel dimorf zijn2. MS treft meer vrouwen dan mannen; Mannen ontwikkelen echter over het algemeen een agressievere vorm van de ziekte. Dit bewijs heeft een essentiële, maar ook complexe, rol van de gonadale hormonen gesuggereerd15; Desalniettemin blijven de rol en het werkingsmechanisme van geslachtshormonen in de pathologie onduidelijk. Bovendien ondersteunen gegevens van diermodellen het idee dat zowel oestrogenen als androgenen op een geslachtsspecifieke manier positieve effecten uitoefenen op verschillende delen van de pathologie16,17.

Sommige studies suggereren ook neuroprotectieve, promyeliniserende en ontstekingsremmende effecten van progesteron18 en, hoewel bewijs bij MS-patiënten schaars is18, kunnen neuroactieve steroïden (d.w.z. de novo gesynthetiseerde steroïden door het zenuwstelsel, zoals pregnenolon, tetrahydroprogesteron en dihydroprogesteron) ook het pathologische beloop beïnvloeden19. Gezamenlijk ondersteunen deze gegevens het idee dat geslachtshormonen die zowel perifeer als in het CZS worden geproduceerd, een belangrijke en geslachtsspecifieke rol spelen bij het ontstaan en de progressie van de ziekte. Daarom dringen we in dit werk aan op het verzamelen van afzonderlijke gegevens van zowel mannelijke als vrouwelijke dieren.

Vanuit histopathologisch oogpunt dient de witte stof van het ruggenmerg als de belangrijkste plaats van CZS-letsel in dit model, dat wordt gekenmerkt door multifocale, confluente regio’s van mononucleaire inflammatoire infiltratie en demyelinisatie8. Bij het beschrijven van dit protocol voor de inductie van MOG35-55-geïnduceerde EAE in C57BL/6J-muizen, zullen we dus rekening houden met de uitkomst van de ziekte bij de twee geslachten en enkele histopathologische inzichten geven met betrekking tot het ruggenmerg.

Protocol

De verzorging en behandeling van de dieren in het kader van dit werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Unie van 22september 2010 (2010/63/UE); alle procedures die in deze studie zijn gerapporteerd, zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (407/2018-PR) en door de ethische commissie van de Universiteit van Turijn (projectnr. 360384). We raden aan om het experimentele ontwerp te conformeren aan de ARRIVE-richtlijnen die oorspronkelijk zijn …

Representative Results

EAE-follow-up na immunisatieDit werd beoordeeld zoals hieronder beschreven. Lichaamsgewicht en voedselinnameDe tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA) (geslacht en tijd als onafhankelijke variabelen) laat een afname zien van het BW van EAE-dieren van beide geslachten, vooral in de tweede week na inductie (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figuur 2A). Het seksuele dimorfisme in BW blijft echter altijd b…

Discussion

Het MOG35-55-geïnduceerde EAE-protocol dat we beschreven leidde tot de ontwikkeling van een chronische vorm van MS in C57BL/6J-muizen 7,8,13. In deze representatieve resultaten rapporteerden we dat de dieren van beide geslachten die de immunisatieprocedure ondergingen, een chronische vorm van de ziekte ontwikkelden (d.w.z. ze herstellen niet volledig na het begin van de ziekte, ze accumuleren tekorten en behouden een…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – MIUR-project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 en 2023-2027 aan Afdeling Neurowetenschappen Rita Levi Montalcini; Cavalieri-Ottolenghi Foundation, Orbassano, Italië. BB was fellow van INFRA-P, regio Piemonte (n.378-35) (2022-2023) en PRIN 2020 – 20203AMKTW. Wij danken Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) voor de steun. De publicatiekosten zijn ondersteund door de vriendelijke donatie van Distretto Rotaract 2031, en in het bijzonder Rotaract Club Torino Nord-Est. Wij danken Elaine Miller voor het proeflezen van ons manuscript.

Materials

18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It’s complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -. C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -. G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida–a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C., Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. Chapter 16 – Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. , 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund’s adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -. J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).

Tags

Keywords: Multiple SclerosisExperimental Autoimmune EncephalomyelitisEAE ModelSex DifferencesMOG35-55Clinical AssessmentNeuroinflammationAutoimmune DiseaseCentral Nervous System
check_url/cn/65778?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image