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神经科学

두 성별의 다발성 경화증 모델링: MOG35-55-유도 실험적 자가면역 뇌척수염

Published: October 13, 2023
doi:
10.3791/65778
, , ,
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”,University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit,University of Camerino, 4Koelliker Hospital

Summary

실험적 자가면역 뇌척수염은 다발성 경화증에서 가장 널리 사용되는 쥐 모델 중 하나입니다. 현재 프로토콜에서는 남녀 모두의 C57BL/6J 마우스에 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드를 면역하여 주로 꼬리와 팔다리의 상행 마비를 초래합니다. 여기서는 EAE 유도 및 평가 프로토콜에 대해 논의합니다.

Abstract

다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 만성 자가면역 염증성 질환입니다. 성별에 따라 유병률이 다르고 남성보다 여성에게 더 많은 영향을 미치며 여성보다 남성에서 더 공격적인 형태를 보이는 다른 결과가 특징입니다. 또한 다발성경화증은 임상적 측면, 방사선학적 및 병리학적 특징 측면에서 매우 이질적입니다. 따라서 병리학의 가능한 한 많은 측면을 조사할 수 있는 실험 동물 모델을 활용할 필요가 있습니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 생쥐에서 가장 많이 사용되는 다발성경화증 모델 중 하나로, 면역 체계 활성화에서 중추신경계 손상에 이르기까지 다양한 질병 특징을 모델링합니다. 여기서 우리는 만성 형태의 질병 발병으로 이어지는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드 35-55(MOG35-55) 면역을 사용하여 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스 모두에서 EAE 유도를 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 예방 접종 후 28일(28dpi) 동안 이 마우스의 일일 임상 점수 및 운동 성능 평가를 보고합니다. 마지막으로, 질병으로 인한 손상의 주요 부위인 척수에 초점을 맞춘 중추신경계 수준의 몇 가지 기본적인 조직학적 분석을 설명합니다.

Introduction

다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 만성 자가면역 염증성 질환입니다. 염증 세포의 혈관 주위 침윤, 탈수초화, 축삭 손실 및 신경교증의 존재를 보여준다1. 이 병의 원인은 아직 밝혀지지 않았으며, 임상적 측면, 방사선 및 병리학적 특징은 이 질병의 현저한 이질성을 시사한다2.

원인이 불분명하고 복잡하기 때문에 현재로서는 인간 MS 3,4에서 나타나는 모든 임상 및 방사선학적 특징을 요약하는 동물 모델이 없습니다. 그러나 MS 3,4의 다양한 측면을 연구하기 위해 다양한 동물 모델이 사용됩니다. 이러한 모델에서 질병 시작은 일반적으로 극도로 인위적이며, 임상 징후의 발병 기간은 인간과 생쥐 간에 다릅니다. 예를 들어, 인간의 경우 질병의 기저에 있는 병태생리학적 과정은 임상 증상이 시작되기 전 수년 동안 감지되지 않습니다. 반대로, 실험자는 다발성경화증 유도 후 몇 주 또는 며칠 이내에 동물 모델에서 증상을 감지할 수 있다4.

세 가지 기본 동물 모델은 다발성경화증의 특징인 탈수초화의 특징을 나타내는데, 바이러스에 의해 유도되는 것(예: Theiler’s murine encephalomyelitis virus), 독성 물질에 의해 유도되는 것(예: cuprizone, lysolecithin), 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 다양한 변이입니다5. 각 모델은 질병의 특정 측면을 연구하는 데 도움이 되지만 MS6의 모든 기능을 복제하는 모델은 없습니다. 따라서 특정 실험 요구 사항과 해결해야 할 과학적 질문을 고려하여 올바른 모델을 선택하는 것이 중요합니다.

미엘린 유래 항원에 대한 면역 절차 덕분에 EAE는 감수성 쥐의 CNS 구성 요소에 대한 자가 면역 반응을 유발하여 유도됩니다. 광범위한 면역병리학적 및 신경병리학적 메커니즘 사이의 상호작용은 면역된 마우스에서 다발성경화증의 주요 병리학적 특성(즉, 염증, 탈수초화, 축삭 손실 및 신경교증)의 발달을 유발합니다 7,8. 생쥐는 면역 접종 후 2주쯤 되면 임상 증상을 보이기 시작하며 일반적으로 꼬리에서 사지, 앞다리까지 상행 마비를 보입니다. 임상 점수(즉, 질병 관련 결손의 누적 정량화)는 일반적으로 5점 척도7를 사용하여 평가된다.

단백질 펩티드를 가진 능동적 면역 또는 뇌 생성 T 세포의 수동적 전달은 다른 유전적 배경을 가진 마우스(예: SJL/J, C57BL/6 및 비만-당뇨병(NOD) 마우스)에서 EAE를 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 미엘린 단백질지질 단백질(PLP), 미엘린 염기성 단백질(MBP) 및 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)은 일반적으로 면역원이 생성되는 자가 CNS 단백질의 예입니다. 특히, PLP의 면역우성 항원결정기(PLP139-151)로 면역된 SJL/J 마우스는 재발-완화(RR) 질병 경과를 보이는 반면, 면역우성 MOG35-55 펩타이드로 면역된 C57BL/6J 마우스는 만성 성질의 EAE를 나타낸다1. 다발성경화증 진행, 질병에서 B 세포의 역할, 내부 메커니즘 또는 재수초화 연구의 어려움에 대한 정보를 거의 제공하지 않는 것과 같은 몇 가지 한계에도 불구하고 EAE 모델은 자가면역 및 신경염증 과정의 이해에 크게 기여하여 다발성경화증 분야의 지식을 증가시켜 이 질병에 대한 새로운 치료 접근법을 개발할 수 있도록 했습니다4, 6.

본 연구에서 우리는 특정 형태의 활성 EAE, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드 35-55(MOG35-55) 유도 형태 9,10,11,12에 초점을 맞췄습니다. MOG35-55 유도 EAE는 만성 형태의 다발성경화증을 모델링합니다. 면역 접종 후, 마우스는 면역 후 첫 주 이내에 무증상 단계를 거친 다음 일반적으로 면역 후 두 번째 주에 질병이 발생하는 반면, 면역 후 3주에서 4주 사이에는 질병이 만성화되어 누적된 결핍에서 완전히 회복될 가능성이 없습니다 7,8,13. 흥미롭게도, 남성과 여성의 질병을 비교한 연구가 더 적음에도 불구하고, 문헌14에 제시된 대부분의 연구에서 발병률, 질병 발병, 경과 또는 진행에 있어 남성과 여성의 차이가 관찰되지 않았다.

대조적으로, 인간의 경우, 이러한 매개변수는 성적으로 매우 이형적인 것으로 알려져있다 2. 다발성경화증은 남성보다 여성에게 더 많이 발생합니다. 그러나 남성은 일반적으로 더 공격적인 형태의 질병을 앓게 된다2. 이 증거는 생식선 호르몬의 본질적이면서도 복잡한 역할을 시사한다15; 그럼에도 불구하고 병리학에서 성 호르몬의 역할과 작용 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 더욱이, 동물 모델의 데이터는 에스트로겐과 안드로겐이 성별에 따라 병리학의 다른 부위에 긍정적인 영향을 미친다는 아이디어를 뒷받침합니다16,17.

일부 연구에서는 프로게스테론의 신경보호, 프로수초화 및 항염증 효과가 있다고 제안하고있으며 , 다발성경화증 환자에 대한 근거는 부족하지만18 신경활성 스테로이드(즉, 프레그네놀론, 테트라하이드로프로게스테론, 디하이드로프로게스테론과 같은 신경계에 의한 새로운 합성 스테로이드)도 병리학적 경과에 영향을 미칠 수 있다19. 종합적으로, 이러한 데이터는 말초신경계와 중추신경계 내부에서 생성되는 성 호르몬이 질병의 발병과 진행에 중요하고 성별에 따라 달라지는 역할을 한다는 생각을 뒷받침합니다. 따라서 본 연구에서는 수컷과 암컷 동물 모두로부터 별도의 데이터를 수집할 것을 촉구합니다.

조직병리학적 관점에서 척수의 백질은 이 모델에서 중추신경계 손상의 주요 부위 역할을 하며, 단핵 염증 침윤 및 탈수초화의 다초점, 합류 영역을 특징으로 한다8. 따라서 C57BL/6J 마우스에서 MOG35-55-유도 EAE 유도를 위한 이 프로토콜을 설명할 때 두 성별의 질병 결과를 고려하고 척수에 관한 몇 가지 조직병리학적 통찰력을 제공할 것입니다.

Protocol

본 작업의 동물 관리 및 취급은 2010년 9 월 22 일 유럽 연합 이사회 지침 (2010 / 63 / UE)에 따라 수행되었습니다. 본 연구에서 보고된 모든 절차는 이탈리아 보건부(407/2018-PR)와 토리노 대학교 윤리위원회(Project n° 360384)의 승인을 받았습니다. 2010년 Kilkenny et al.이 처음 발표한 ARRIVE 가이드라인에 따라 실험 설계를 준수할 것을 제안합니다20. 시작하기 전에 필요한 재료를 사용?…

Representative Results

예방 접종 후 EAE 후속 조치이것은 아래에 설명된 대로 평가되었습니다. 체중 및 음식 섭취량이원 분산 분석(ANOVA)(독립 변수로서의 성별 및 시간)은 특히 유도 후 2주 이내에 남녀 모두의 EAE 동물의 BW가 감소했음을 보여줍니다(F(1,57) = 4.952, p < 0.001; 그림 2A). 그러나 BW의 성적 이형성은 항상 유지됩니다(<…

Discussion

우리가 기술한 MOG35-55-유도 EAE 프로토콜은 C57BL/6J 마우스 7,8,13에서 만성 형태의 MS를 개발하게 했다. 이러한 대표적인 결과에서, 우리는 예방접종 절차를 거친 암수 동물이 만성적인 형태의 질병을 발병시켰다고 보고했다(즉, 질병 발병 후 완전히 회복되지 않고, 결핍이 누적되며, 만성 단계에서 CS가 1.5 이상을 유지함).<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 및 2023-2027에서 신경과학과 Rita Levi Montalcini의 지원을 받았습니다. Cavalieri-Ottolenghi 재단, 오르바사노, 이탈리아. BB는 INFRA-P, Piedmont Region(n.378-35)(2022-2023) 및 PRIN 2020-20203AMKTW의 펠로우였습니다. 지원을 해주신 Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus(FORB)에 감사드립니다. 출판비는 2031 디스트레토 로타랙트, 특히 토리노 노르-에스트 로타랙트클럽의 기부금으로 충당되었다. 원고를 교정해 주신 Elaine Miller에게 감사드립니다.

Materials

18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic
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References

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Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).
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