实验性自身免疫性脑脊髓炎是目前最常用的多发性硬化小鼠模型之一。在本方案中，对两种性别的C57BL/6J小鼠使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽进行免疫，主要导致尾巴和肢体的上升性轻瘫。本文将讨论EAE的诱导与评估方案。
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摘要
摘要
多发性硬化症（MS）是一种影响中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性炎症性疾病。该病在性别间具有不同的发病率，女性患者多于男性，但疾病转归存在差异，男性通常表现为更严重的疾病形式。此外，MS在临床表现、影像学特征及病理学特征方面具有高度异质性。因此，有必要利用实验性动物模型，以尽可能全面地研究该疾病的多个方面。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是小鼠中最常用的MS模型之一，可模拟从免疫系统激活到中枢神经系统损伤等多种疾病特征。本文介绍了一种使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）免疫诱导雌性和雄性C57BL/6J小鼠产生慢性EAE的实验方案。我们还报告了免疫后28天内（28 dpi）小鼠每日临床评分及运动功能的评估结果。最后，我们展示了在中枢神经系统水平进行的一些基本组织学分析，重点关注脊髓——疾病所致损伤的主要部位。
引言
多发性硬化症（MS）是一种影响中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性炎症性疾病。其特征包括血管周围炎性细胞浸润、脱髓鞘、轴突丢失和胶质增生1。该病的病因尚不明确，其临床表现、影像学及病理特征提示疾病具有显著的异质性2。
由于病因未明且疾病复杂，目前尚无动物模型能够完全重现人类多发性硬化症（MS）的所有临床和影像学特征3,4。然而，已有多种动物模型被用于研究MS的不同方面3,4。在这些模型中，疾病诱导通常具有高度人为性，且临床症状出现的时间框架在人类与小鼠之间存在差异。例如，在人类中，疾病的病理生理过程在临床症状出现前数年均难以察觉；而在动物模型中，实验者可在诱导MS后数周甚至数天内即观察到症状4。
三种基本的动物模型可产生多发性硬化症（MS）特征性的脱髓鞘表现：病毒诱导型（例如，Theiler小鼠脑脊髓炎病毒）、毒性物质诱导型（例如，铜唑酮、溶血卵磷脂）以及实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的不同变体5
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方案
本研究中的动物护理和操作均按照2010年9月22日欧洲联盟理事会指令2010/63/EU的规定进行。nd 2010年9月（2010/63/UE）；本研究中报告的所有操作程序均获得意大利卫生部（407/2018-PR）和都灵大学伦理委员会（项目编号° 360384）。我们建议实验设计应遵循 Kilkenny 等人于 2010 年首次发布的 ARRIVE 指南。20开始之前，请确保已备齐所需材料（参见 材料表）。用于制备MOG的所有玻璃器皿和器具均需灭菌35-55 在高压灭菌器中乳化。实验步骤的概要如下所示： 图1.
1. MOG35-55 乳剂的制备
注意：为制备乳剂，需将 MOG35-55不完全弗氏佐剂（IFA） 结核分枝杆菌 H37Ra 菌株（MT）和生理溶液是必需的（参见 材料表).
注意：热灭活的分枝杆菌（MT）可刺激先天免疫反应。操作时应使用适当的个人防护装备，并在通风橱内将MT置于密闭的精密天平上....
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结果
免疫后EAE的随访
按以下所述进行评估。
体重与食物摄入
双因素方差分析（ANOVA）（以性别和时间为自变量）显示，两种性别的EAE动物体重（BW）均下降，尤其在诱导后的第二周内尤为明显（F(1,57) = 4.952，p < 0.001；图2A）。然而，体重的性别二态性始终得以维持（图2A）。就体重百分比变化而言（F(1,57) = 23.935，p < 0.001；图2B），雄性和雌性动物在诱导后第12天至第17天期间均出现显著的体重下降（p < 0.001），与初始体重相比，但总体体重损失从未超过20%（图2B
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讨论
我们所描述的MOG35-55诱导EAE方案导致C57BL/6J小鼠出现慢性形式的多发性硬化症7,8,13。在这些代表性结果中，我们报告指出，接受免疫程序的两种性别的动物均发展为慢性疾病形式（即发病后无法完全恢复，神经功能缺损持续累积，并在慢性期至少维持1.5的临床评分）。
尽管许多研究报道在此模型中雄性和雌性之间无差异14，但仅有少数研究同时纳入了两种性别。然而，鉴于多发性硬化症（MS）中存在显著的性二型性2，研究两种性别中的疾病结局应具有首要重要性。得益于近期更多同时包含两种性别的研究，已在MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中描述了某些性二型性的存在35。我们主要注意到，在雌性中，MO.......
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披露
所有作者均声明在本论文的研究、撰写和/或发表方面不存在任何利益冲突。
致谢
本工作得到了意大利教育、大学与研究部（Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR）卓越部门项目（Dipartimenti di Eccellenza）2018-2022年和2023-2027年对Rita Levi Montalcini神经科学系的资助，以及意大利奥尔巴萨诺Cavalieri-Ottolenghi基金会的支持。BB获得了皮埃蒙特大区INFRA-P项目（编号378-35）（2022-2023年）和PRIN 2020项目（编号20203AMKTW）的资助。我们感谢意大利非营利生物医学研究基金会（Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus, FORB）提供的支持。本文出版费用由国际扶轮社2031地区扶青社（Distretto Rotaract 2031）以及特别支持的都灵东北扶青社（Rotaract Club Torino Nord-Est）的慷慨捐助承担。我们感谢Elaine Miller对本文稿的校对工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 G × 1 ½“ 用于玻璃注射器的1.2 x 40 mm针头 | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| 与光学显微镜连接的数码相机 | 尼康 DS-U1 数码相机 | ||
| 电子精密天平 | 默克 | Mod. Kern-440-47N，分辨率 0.1 g | |
| 伊红Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| 玻璃注射器移液管 “超无菌” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| 玻璃器皿（例如，用于制备乳剂的烧杯） | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| 苏木精（Mayer）’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | 使用前过滤。 |
| 图像分析软件 | Fiji | ||
| 不完全弗氏佐剂’不完全佐剂（IFA） | Sigma-Aldrich | F5506 | 4°C 保存 °C. |
| 异氟烷 | 威洛娜制药 | 该药物用作吸入性麻醉剂。 | |
| 雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室，恩维戈 | 8至10周龄，最佳体重约为20 g。 | |
| 切片机 | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| 封片剂 | 默克 | 107961 | |
| 小鼠转棒实验 | Ugo Basile | #47600 | |
| 分枝杆菌属 结核分枝杆菌（MT），H37Ra 菌株 | Difco Laboratories Inc. | 231141 | 4°C 保存 °C. |
| 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55) | Espikem | EPK1 | -80°C 保存 °C 在生理盐水中稀释（2 mg/mL）；应在免疫当天配制，以尽可能避免发生变性或污染。 |
| 光学显微镜 | 尼康 Eclipse 90i | ||
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich | 158127 | 4°C 保存 °C 在磷酸盐缓冲液中稀释至4%。 |
| 百日咳毒素（PT） | Duotech | PT.181 | -80°C 保存°C稀释（浓度5 µg/mL）生理溶液中 |
| 生理盐水（0.9%氯化钠溶液） | B. Eurospital | A 032182038 | 4°C 保存 °一旦打开。 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技 | J61196.AP | |
| 图像采集软件 | NIS-Element AR 2.10 | ||
| U-100 0.5 mL 注射器，配 30 G × 5/16 针头” （0.30 × 8 mm）固定针头 | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| U-100 1 mL 注射器，带 26G 针头 ½” （0.45 × 12.7 mm）针头 | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| 兽用眼膏 | Lacrilube，Lacrigel Europhta | ||
| 赛拉嗪 | Rompun | 这种药物混合物用作注射用麻醉剂和镇静剂。 | |
| 唑拉西泮和替来他明 | Zoletil 100 | 该药物用作注射用麻醉剂、镇静剂、肌肉松弛剂和镇痛剂 |
参考文献
- Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
- Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 2/16/2024. Citeable Link.
An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.
