מידול טרשת נפוצה בשני המינים: MOG35-induced ניסיוני אוטואימוני אנצפלומיאליטיס
Summary
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית היא אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה. בפרוטוקול הנוכחי, עכברי C57BL/6J משני המינים מחוסנים בפפטיד גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין, וכתוצאה מכך בעיקר פרזיס עולה של הזנב והגפיים. כאן אנו דנים בפרוטוקול של אינדוקציה והערכה של EAE.
Abstract
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה דלקתית אוטואימונית כרונית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית (CNS). היא מאופיינת בשכיחות שונה בין המינים, המשפיעה על יותר נשים מגברים, ותוצאות שונות, המראות צורות אגרסיביות יותר אצל גברים מאשר אצל נשים. יתר על כן, טרשת נפוצה היא הטרוגנית מאוד במונחים של היבטים קליניים, רדיולוגיים ופתולוגיים. לכן, יש צורך לנצל מודלים בעלי חיים ניסיוניים המאפשרים חקירה של היבטים רבים ככל האפשר של הפתולוגיה. אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) מייצגת את אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה בעכברים, המדמה תכונות מחלה שונות, החל מהפעלת מערכת החיסון ועד נזק למערכת העצבים המרכזית. כאן אנו מתארים פרוטוקול להשראת EAE בעכברי C57BL/6J זכריים ונקביים כאחד באמצעות חיסון מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין פפטיד 35-55 (MOG35-55), מה שמוביל להתפתחות צורה כרונית של המחלה. אנו גם מדווחים על הערכת התוצאה הקלינית היומית והביצועים המוטוריים של עכברים אלה במשך 28 ימים לאחר החיסון (28 dpi). לבסוף, אנו מדגימים כמה ניתוחים היסטולוגיים בסיסיים ברמת מערכת העצבים המרכזית, תוך התמקדות בחוט השדרה כאתר העיקרי של נזק הנגרם על ידי מחלה.
Introduction
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה דלקתית אוטואימונית כרונית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית (CNS). זה מראה את נוכחותם של חדירה perivascular של תאים דלקתיים, demyelination, אובדן אקסונלי, gliosis1. האטיולוגיה שלה נותרה לא ידועה, וההיבטים הקליניים שלה, המאפיינים הרדיוגרפיים והפתולוגיים מצביעים על הטרוגניות יוצאת דופן במחלה2.
בשל האטיולוגיה והמורכבות הלא ידועות שלה, נכון לעכשיו, אף מודל של בעלי חיים אינו משחזר את כל התכונות הקליניות והרדיולוגיות המוצגות בטרשת נפוצה 3,4 אנושית. עם זאת, מודלים שונים של בעלי חיים משמשים לחקר היבטים שונים של טרשת נפוצה 3,4. במודלים אלה, התחלת המחלה היא בדרך כלל מלאכותית ביותר, ומסגרת הזמן של הופעת סימנים קליניים שונה בין בני אדם לעכברים. לדוגמה, בבני אדם, התהליכים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס המחלה אינם מזוהים במשך שנים לפני הופעת הביטויים הקליניים. לעומת זאת, הנסיינים יכולים לזהות תסמינים במודלים של בעלי חיים בתוך שבועות או אפילו ימים לאחר השראת טרשת נפוצה4.
שלושה מודלים בסיסיים של בעלי חיים מייצרים את התכונות של דה-מיאלינציה האופייניות לטרשת נפוצה: אלה המושרות על ידי וירוסים (למשל, וירוס האנצפלומיאליטיס מורין של טיילר), אלה המושרים על ידי חומרים רעילים (למשל, cuprizone, lysolecithin), והגרסאות השונות של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE)5. כל מודל מסייע לחקור היבטים ספציפיים של המחלה, אך אף אחד מהם אינו משכפל את כל התכונות של MS6. לכן, קריטי לבחור את המודל הנכון בהתחשב בצרכים הניסיוניים הספציפיים ובשאלות המדעיות שיש להתייחס אליהן.
הודות להליכי חיסון נגד אנטיגנים שמקורם במיאלין, EAE נגרם על ידי הפעלת תגובה אוטואימונית לרכיבי CNS בעכברים רגישים. יחסי הגומלין בין מגוון רחב של מנגנונים אימונופתולוגיים ונוירופתולוגיים גורמים להתפתחות תכונות פתולוגיות עיקריות של טרשת נפוצה (כלומר, דלקת, דמיאלינציה, אובדן אקסונלי וגליוזיס) בעכברים המחוסנים 7,8. עכברים מתחילים להראות תסמינים קליניים סביב השבוע השני לאחר החיסון ובדרך כלל מראים שיתוק עולה מהזנב לגפה ולגפה הקדמית. הציון הקליני (כלומר, כימות הצטברות של ליקויים הקשורים למחלה) מוערך בדרך כלל באמצעות סולם7 בן 5 נקודות.
חיסון פעיל עם חלבון או פפטיד או העברה פסיבית של תאי T אנצפליטוגניים יכול לשמש כדי לגרום EAE בעכברים עם רקע גנטי שונה (למשל, SJL/J, C57BL/6, ועכברים שאינם שמנים סוכרתיים (NOD). חלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP), חלבון בסיסי מיאלין (MBP) וגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) הם דוגמאות לחלבונים במערכת העצבים המרכזית העצמית שמהם מיוצרים בדרך כלל אימונוגנים. בפרט, עכברי SJL/J שחוסנו באפיטופ החיסוני הדומיננטי של PLP (PLP139-151) מפתחים מהלך מחלה התקפי-הפוגתי (RR), בעוד שעכברי C57BL/6J שחוסנו בפפטיד MOG35-55 החיסוני הדומיננטי מראים EAE בעל אופי כרוני1. למרות מגבלות מסוימות, כגון מתן מידע מועט מאוד על התקדמות טרשת נפוצה, תפקידם של תאי B במחלה, מנגנוני האינסייד אאוט, או קשיים בחקר רמיאלינציה, המודלים של EAE תרמו רבות להבנת תהליכים אוטואימוניים ונוירו-דלקתיים, הגדילו את הידע בתחום הטרשת הנפוצה ובכך אפשרו פיתוח גישות טיפוליות חדשניות למחלה זו4, 6.
בעבודה הנוכחית התמקדנו בצורה מסוימת של EAE פעיל, פפטיד הגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין 35-55 (MOG35-55) המושרה בצורה 9,10,11,12. מודל EAE המושרה על ידי MOG35-55 הוא צורה כרונית של טרשת נפוצה. לאחר החיסון, העכברים עוברים שלב א-סימפטומטי בשבוע הראשון לאחר החיסון, לאחר מכן המחלה מופיעה בדרך כלל בשבוע השני לאחר החיסון, ואילו בין השבוע השלישי לרביעי לאחר החיסון, המחלה הופכת כרונית, ללא אפשרות להחלמה מלאה מהגירעונות המצטברים 7,8,13. באופן מעניין, ברוב המחקרים הקיימים בספרות14 לא נצפים הבדלים בין זכרים לנקבות בשכיחות, בהתפרצות המחלה, במהלכם או בהתקדמותה, גם אם פחות מחקרים משווים את המחלה בזכרים ובנקבות.
לעומת זאת, אצל בני אדם, פרמטרים אלה ידועים כדימורפיים מאוד מבחינה מינית2. טרשת נפוצה משפיעה על יותר נשים מאשר גברים; עם זאת, גברים בדרך כלל לפתח צורה אגרסיבית יותר של המחלה2. ראיות אלה הצביעו על תפקיד חיוני, כמו גם מורכב, של הורמוני הגונדל15; עם זאת, תפקידם ומנגנון הפעולה של הורמוני המין בפאתולוגיה נותרו לא ברורים. יתר על כן, נתונים ממודלים של בעלי חיים תומכים ברעיון שגם אסטרוגנים וגם אנדרוגנים מפעילים השפעות חיוביות על חלקים שונים של הפתולוגיה באופן ספציפי למין16,17.
מחקרים מסוימים מציעים גם השפעות נוירופרוטקטיביות, פרומיאלינטיות ואנטי דלקתיות של פרוגסטרון18 , ואף על פי שהראיות בחולי טרשת נפוצה הן נדירות18, סטרואידים נוירואקטיביים (כלומר, סטרואידים מסונתזים דה נובו על ידי מערכת העצבים, כגון פרגננולון, טטרהידרופרוגסטרון ודיהידרופרוגסטרון) עשויים להשפיע גם על הקורס הפתולוגי19. באופן קולקטיבי, נתונים אלה תומכים ברעיון כי הורמוני מין המיוצרים הן באופן היקפי והן בתוך מערכת העצבים המרכזית יש תפקיד חשוב וספציפי למין בהתפרצות המחלה והתקדמותה. לכן, בעבודה הנוכחית, אנו קוראים לאיסוף נתונים נפרדים הן מבעלי חיים זכריים והן מנקבות.
מנקודת מבט היסטופתולוגית, החומר הלבן של חוט השדרה משמש כאתר העיקרי של פגיעה במערכת העצבים המרכזית במודל זה, המאופיין באזורים רב-מוקדיים, מתמזגים של חדירה דלקתית חד-גרעינית ודמיאלינציה8. לכן, בתיאור פרוטוקול זה להשראת EAE המושרה על ידי MOG35-55-induced EAE בעכברי C57BL/6J, ניקח בחשבון את תוצאות המחלה בשני המינים ונספק כמה תובנות היסטופתולוגיות לגבי חוט השדרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול EAE המושרה על ידי MOG35-55 שתיארנו הוביל לפיתוח צורה כרונית של טרשת נפוצה בעכברי C57BL/6J 7,8,13. בתוצאות מייצגות אלה, דיווחנו כי בעלי חיים משני המינים שעברו את הליך החיסון פיתחו צורה כרונית של המחלה (כלומר, הם אינם מחלימים לחלוטין לאחר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 ו- 2023-2027 למחלקה למדעי המוח ריטה לוי מונטלצ’יני; קרן קאבליירי-אוטולנגי, אורבסאנו, איטליה. BB היה עמית של INFRA-P, אזור פיימונטה (n.378-35) (2022-2023) ו-PRIN 2020-20203AMKTW. אנו מודים ל-Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) על התמיכה. דמי הפרסום נתמכו על ידי התרומה הנדיבה של Distretto Rotaract 2031, ובמיוחד, Rotaract Club Torino Nord-Est. אנו מודים לאיליין מילר על ההגהה של כתב היד שלנו.
Materials
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
References
- Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
- Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
- Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
- Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , (2001).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
- Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
- Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
- Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
- Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
- McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It’s complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
- Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
- Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
- Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -. C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
- Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
- Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -. G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
- Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
- vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
- Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida–a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C., Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. Chapter 16 – Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. , 308-379 (2009).
- Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
- Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
- Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
- Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
- Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
- Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund’s adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
- Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
- Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
- Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -. J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
- Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).
