تحسين ثقافة الخلايا الظهارية للعدسة الأساسية للماوس: دليل شامل للتربسين
Summary
تحدد هذه المخطوطة بروتوكول فيديو مفصل لزراعة الخلايا الظهارية للعدسة الأولية (LECs) ، بهدف تحسين قابلية التكاثر والمساعدة في البحث في إعتام عدسة العين وعتامة الكبسولة الخلفية (PCO). يقدم إرشادات خطوة بخطوة حول تشريح العدسة ، وعزل LECs ، والتحقق من صحتها ، وهو بمثابة دليل قيم ، خاصة للوافدين الجدد في هذا المجال.
Abstract
تلعب الخلايا الطلائية للعدسة (LECs) أدوارا مهمة متعددة في الحفاظ على الاتزان الداخلي للعدسة ووظيفتها الطبيعية. تحدد LECs نمو العدسة وتطورها وحجمها وشفافيتها. على العكس من ذلك ، يمكن أن تؤدي LECs المختلة وظيفيا إلى تكوين إعتام عدسة العين وعتامة الكبسولة الخلفية (PCO). وبالتالي ، فإن إنشاء نظام زراعة LEC أولي قوي أمر مهم للباحثين المشاركين في تطوير العدسات والكيمياء الحيوية وعلاجات إعتام عدسة العين والوقاية من PCO. ومع ذلك، فإن زراعة المجتمعات المحلية منخفضة الاستهلاك الأولية تمثل تحديات منذ فترة طويلة بسبب محدودية توافرها، وبطء معدل انتشارها، وطبيعتها الحساسة.
تعالج هذه الدراسة هذه العقبات من خلال تقديم بروتوكول شامل لثقافة LEC الأولية. ويشمل البروتوكول خطوات أساسية مثل صياغة وسط استزراع محسن، وعزل دقيق لكبسولات العدسات، وتقنيات التربسين، وإجراءات الاستزراع الفرعي، وبروتوكولات الحصاد، والمبادئ التوجيهية للتخزين والشحن. طوال عملية الاستزراع ، تمت مراقبة مورفولوجيا الخلية باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور.
لتأكيد صحة LECs المستزرعة ، تم إجراء فحوصات التألق المناعي للكشف عن وجود وتوزيع بروتينات العدسة الحرجة ، وهي αA و γ-crystallins. يزود هذا البروتوكول المفصل الباحثين بمورد قيم لزراعة وتوصيف LECs الأولية ، مما يتيح التقدم في فهمنا لبيولوجيا العدسة وتطوير استراتيجيات علاجية للاضطرابات المرتبطة بالعدسات.
Introduction
تلعب عدسة العين دورا حاسما في الرؤية من خلال تركيز الضوء الوارد على شبكية العين. وهو يتألف من بنية شفافة غير وعائية تتكون من خلايا متخصصة ، من بينها الخلايا الظهارية للعدسة (LECs) هي اللاعبين الرئيسيين. تقع LECs على السطح الأمامي للعدسة وهي مسؤولة عن الحفاظ على شفافيتها وتنظيم توازن الماء والمشاركة في نمو العدسةوتطورها 1,2. LECs هي نوع فريد من الخلايا الموجودة في الجزء الأمامي من العدسة ، وتلعب دورا مهما في الحفاظ على وضوح العدسة ووظيفتها من خلال إنتاج ألياف العدسة باستمرار طوال الحياة.
يتميز إعتام عدسة العين بالتعتيم التدريجي للعدسة ، مما يؤدي إلى تشويه الضوء وتشتته ، مما يؤدي إلى ضعف الرؤية 3,4. الآليات الدقيقة الكامنة وراء تكوين إعتام عدسة العين معقدة ومتعددة العوامل ، وتشمل عمليات خلوية وجزيئية مختلفة مثل الأشعة فوق البنفسجية ، والضرر التأكسدي ، والجلوكوز 5,6. تم العثور على LECs لتساهم بشكل كبير في تطوير إعتام عدسة العين ، مما يجعلها محورا حيويا للبحث1،2،7،8،9.
علاوة على ذلك ، فإن إحدى القضايا الأكثر إلحاحا في طب العيون اليوم هي الارتفاع النسبي في معدل عتامة الكبسولة الخلفية (PCO) ، المعروف أيضا باسم إعتام عدسة العين الثانوي. يظل PCO أكثر المضاعفات شيوعا بعد جراحة إعتام عدسة العين ، حيث يؤثر على ما يصل إلى 20-40٪ من المرضى البالغين و 100٪ من الأطفال في غضون 5 سنوات بعد الجراحة10. يحدث PCO بشكل أساسي بسبب LECs المتبقية التي تبقى في كيس المحفظة بعد استخراج إعتام عدسة العين. تخضع هذه الخلايا لتحول فيزيولوجي مرضي متعدد الأوجه لا يشمل فقط الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) ولكن أيضا تمايز LECs إلى ألياف العدسة ، مما يؤدي إلى عدد الخلايا الذي يتكون من مزيج من LECs والألياف والخلايا الليفية العضلية11،12،13. تتكاثر الخلايا المحولة وتهاجر عبر كبسولة العدسة الخلفية ، مما يؤدي إلى ضعف البصر. يمكن أن يوفر فهم السلوك وآليات التحكم في LECs في نماذج الاستزراع رؤى قيمة حول الوقاية من PCO وإدارته. لذلك ، يقدم هذا البروتوكول لزراعة LECs أداة حيوية لباحثي طب العيون الذين يهدفون إلى دراسة وفهم ومكافحة هذه المضاعفات السائدة بعد العملية الجراحية في نهاية المطاف.
لكشف تعقيدات بيولوجيا LEC ودورها في تكوين إعتام عدسة العين و PCO ، من الضروري إنشاء أنظمة زراعة خلايا أولية قوية وقابلة للتكرار في المختبر . توفر ثقافة LEC الأولية للباحثين بيئة خاضعة للرقابة لدراسة الوظائف والإشارات والخصائص الجزيئية ل LECs. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بالتحقيق في العمليات الخلوية وتأثيرات الظروف التجريبية المختلفة ، مما يوفر رؤى قيمة في فسيولوجيا العدسة وعلم الأمراض.
لقد أثرت الأبحاث السابقة فهمنا لتقنيات زراعة LEC14،15،16،17،18،19،20. على الرغم من أن هذه الدراسات قد استخدمت منهجيات مختلفة وأسفرت عن نتائج مهمة حول سلوك وخصائص LEC ، إلا أن بروتوكول تسجيل الفيديو الشامل والمتاح لزراعة LECs غائب في الأدبيات الحالية. يمكن أن يعيق هذا القيد قدرة الباحثين المبتدئين على إعادة إنتاج التقنيات بدقة ويمكن أن يؤدي إلى تناقضات واختلافات في النتائج التجريبية. من خلال توفير بروتوكول تسجيل الفيديو ، تهدف هذه الورقة البحثية إلى سد هذه الفجوة وتوفير مورد موحد يمكن أن يعزز قابلية التكاثر ويسهل نقل المعرفة في مجال ثقافة LEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول المقدم في هذه الورقة دليلا شاملا خطوة بخطوة للعزلة الناجحة والثقافة والثقافة الفرعية للمجتمعات المحلية الأولية ، مع استكمال وثائق الفيديو المصاحبة. يعزز الدليل المرئي المفصل إلى جانب التعليمات المكتوبة وضوح البروتوكول وإمكانية الوصول إليه ، مما يعزز استخدامه وإمكانية ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل NEI R21EY033941 (إلى Hongli Wu) ؛ وزارة الدفاع W81XWH2010896 (إلى هونغلي وو) ؛ R15GM123463-02 (من كايلا جرين وهونجلي وو)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture–iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients – association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells – relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. 发育生物学. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
