Optimalisatie van de epitheelcelcultuur van de primaire lens van muizen: een uitgebreide gids voor trypsinisatie
Summary
Dit manuscript schetst een gedetailleerd videoprotocol voor het kweken van primaire lensepitheelcellen (LEC’s), met als doel de reproduceerbaarheid te verbeteren en onderzoek naar cataract en posterieure capsule-opacificatie (PCO) te ondersteunen. Het biedt stapsgewijze instructies over lensdissectie, LEC-isolatie en validatie en dient als een waardevolle gids, vooral voor nieuwkomers in het veld.
Abstract
Lensepitheelcellen (LEC’s) spelen meerdere belangrijke rollen bij het handhaven van de homeostase en de normale functie van de lens. LEC’s bepalen de groei, ontwikkeling, grootte en transparantie van lenzen. Omgekeerd kunnen disfunctionele LEC’s leiden tot cataractvorming en opacificatie van het achterste kapsel (PCO). Daarom is het opzetten van een robuust primair LEC-kweeksysteem belangrijk voor onderzoekers die zich bezighouden met lensontwikkeling, biochemie, cataracttherapieën en PCO-preventie. Het cultiveren van primaire LEC’s heeft echter lange tijd uitdagingen opgeleverd vanwege hun beperkte beschikbaarheid, trage proliferatiesnelheid en delicate aard.
Deze studie pakt deze hindernissen aan door een uitgebreid protocol voor de primaire LEC-cultuur te presenteren. Het protocol omvat essentiële stappen zoals de formulering van een geoptimaliseerd kweekmedium, nauwkeurige isolatie van lenscapsules, trypsinisatietechnieken, subcultuurprocedures, oogstprotocollen en richtlijnen voor opslag en verzending. Gedurende het hele kweekproces werd de celmorfologie gecontroleerd met behulp van fasecontrastmicroscopie.
Om de authenticiteit van de gekweekte LEC’s te bevestigen, werden immunofluorescentietests uitgevoerd om de aanwezigheid en subcellulaire distributie van kritische lenseiwitten, namelijk αA- en γ-kristallijnen, te detecteren. Dit gedetailleerde protocol voorziet onderzoekers van een waardevolle bron voor het cultiveren en karakteriseren van primaire LEC’s, waardoor vooruitgang wordt geboekt in ons begrip van lensbiologie en de ontwikkeling van therapeutische strategieën voor lensgerelateerde aandoeningen.
Introduction
De lens van het oog speelt een cruciale rol bij het gezichtsvermogen door invallend licht op het netvlies te focussen. Het bestaat uit een transparante, avasculaire structuur die bestaat uit gespecialiseerde cellen, waaronder lensepitheelcellen (LEC’s) belangrijke spelers zijn. LEC’s bevinden zich aan de voorkant van de lens en zijn verantwoordelijk voor het handhaven van de transparantie, het reguleren van de waterbalans en het deelnemen aan de groei en ontwikkeling van de lens 1,2. LEC’s zijn een uniek type cellen dat zich aan de voorkant van de lens bevindt en een cruciale rol speelt bij het behouden van de helderheid en functie van de lens door gedurende het hele leven continu lensvezels te produceren.
Staar wordt gekenmerkt door de progressieve vertroebeling van de lens, wat resulteert in vervorming en verstrooiing van licht, wat leidt tot een verminderd gezichtsvermogen 3,4. De precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van cataract zijn complex en multifactorieel, waarbij verschillende cellulaire en moleculaire processen betrokken zijn, zoals UV-straling, oxidatieve schade en glycatie5,6. LEC’s blijken aanzienlijk bij te dragen aan de ontwikkeling van staar, waardoor ze een essentieel aandachtspuntvan onderzoek zijn 1,2,7,8,9.
Bovendien is een van de meest urgente problemen in de oogheelkunde tegenwoordig de relatief hoge incidentie van opacificatie van het achterste kapsel (PCO), ook bekend als secundair cataract. PCO blijft de meest voorkomende complicatie na een staaroperatie en treft tot 20-40% van de volwassen patiënten en 100% van de kinderen binnen 5 jaarna de operatie. PCO wordt voornamelijk veroorzaakt door de resterende LEC’s die in de capsulaire zak achterblijven na cataractextractie. Deze cellen ondergaan een veelzijdige pathofysiologische transformatie waarbij niet alleen de epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) betrokken is, maar ook de differentiatie van LEC’s naar lensvezels, wat resulteert in een celpopulatie die een mengsel is van LEC’s, vezels en myofibroblasten 11,12,13. De getransformeerde cellen vermenigvuldigen zich en migreren over het achterste lenskapsel, wat leidt tot slechtziendheid. Inzicht in het gedrag en de controlemechanismen van LEC’s in kweekmodellen kan waardevolle inzichten opleveren in de preventie en het beheer van PCO. Daarom is dit protocol voor het kweken van LEC’s een essentieel hulpmiddel voor oogheelkundige onderzoekers die deze veel voorkomende postoperatieve complicatie willen bestuderen, begrijpen en uiteindelijk bestrijden.
Om de fijne kneepjes van LEC-biologie en haar rol in cataractvorming en PCO te ontrafelen, is het essentieel om robuuste en reproduceerbare in vitro primaire celkweeksystemen op te zetten. Primaire LEC-cultuur biedt onderzoekers een gecontroleerde omgeving om de functies, signalering en moleculaire kenmerken van LEC’s te bestuderen. Bovendien maakt het het mogelijk om cellulaire processen en de effecten van verschillende experimentele omstandigheden te onderzoeken, wat waardevolle inzichten oplevert in de fysiologie en pathologie van lenzen.
Eerder onderzoek heeft ons begrip van LEC-kweektechnieken verrijkt: 14,15,16,17,18,19,20. Hoewel deze studies verschillende methodologieën hebben gebruikt en significante bevindingen hebben opgeleverd over LEC-gedrag en -kenmerken, ontbreekt een uitgebreid en toegankelijk video-opnameprotocol voor het kweken van LEC’s in de huidige literatuur. Deze beperking kan het vermogen van beginnende onderzoekers om de technieken nauwkeurig te reproduceren belemmeren en kan leiden tot inconsistenties en variaties in experimentele resultaten. Door een video-opnameprotocol te bieden, wil dit onderzoeksartikel deze kloof overbruggen en een gestandaardiseerde bron bieden die de reproduceerbaarheid kan verbeteren en kennisoverdracht op het gebied van LEC-cultuur kan vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, biedt een uitgebreide, stapsgewijze handleiding voor de succesvolle isolatie, cultuur en subcultuur van primaire LEC’s, compleet met bijbehorende videodocumentatie. De gedetailleerde visuele gids naast de schriftelijke instructies verbetert de duidelijkheid en toegankelijkheid van het protocol en bevordert het gebruik en de reproduceerbaarheid ervan onder onderzoekers in het veld. Het uiteindelijke doel is om bij te dragen aan de groeiende hoeveelheid kennis over de ro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NEI R21EY033941 (aan Hongli Wu); Ministerie van Defensie W81XWH2010896 (naar Hongli Wu); R15GM123463-02 (aan Kayla Green en Hongli Wu)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture–iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients – association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells – relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. 发育生物学. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
