אופטימיזציה של תרבית תאי אפיתל בעדשה הראשית של עכבר: מדריך מקיף לטריפסיניזציה
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול וידאו מפורט לגידול תאי אפיתל ראשוניים של עדשה (LECs), במטרה לשפר את יכולת השחזור ולסייע במחקר בקטרקט ובפסיפיקציה של קפסולה אחורית (PCO). הוא מציע הוראות שלב אחר שלב על דיסקציה של עדשות, בידוד LECs ותיקוף, ומשמש כמדריך רב ערך, במיוחד עבור מצטרפים חדשים בתחום.
Abstract
תאי אפיתל עדשה (LECs) ממלאים תפקידים חשובים רבים בשמירה על ההומאוסטזיס ותפקוד תקין של העדשה. LECs קובעים את צמיחת העדשה, התפתחותה, גודלה ושקיפותה. לעומת זאת, LECs לא מתפקדים יכולים להוביל להיווצרות קטרקט ו opacification קפסולה אחורית (PCO). כתוצאה מכך, הקמת מערכת תרבית LEC ראשונית חזקה חשובה לחוקרים העוסקים בפיתוח עדשות, ביוכימיה, טיפולי קטרקט ומניעת PCO. עם זאת, טיפוח LECs ראשוניים הציב זה מכבר אתגרים בשל זמינותם המוגבלת, קצב ההתרבות האיטי ואופיים העדין.
מחקר זה מתמודד עם מכשולים אלה על ידי הצגת פרוטוקול מקיף לתרבות LEC ראשונית. הפרוטוקול כולל שלבים חיוניים כגון גיבוש מדיום תרבית אופטימלי, בידוד מדויק של קפסולות עדשה, טכניקות טריפסיניזציה, נהלי תת-תרבית, פרוטוקולי קציר והנחיות לאחסון ומשלוח. לאורך כל תהליך התרבית, המורפולוגיה של התא נוטרה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
כדי לאשר את האותנטיות של LECs בתרבית, נערכו בדיקות immunofluorescence כדי לזהות את הנוכחות ואת ההתפלגות התת-תאית של חלבוני עדשה קריטיים, כלומר αA ו-γ-crystallins. פרוטוקול מפורט זה מצייד את החוקרים במשאב רב ערך לטיפוח ואפיון LECs ראשוניים, ומאפשר התקדמות בהבנת הביולוגיה של העדשה ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות להפרעות הקשורות לעדשות.
Introduction
עדשת העין ממלאת תפקיד מכריע בראייה על ידי מיקוד האור הנכנס על הרשתית. הוא מורכב ממבנה שקוף, אווסקולרי המורכב מתאים מיוחדים, ביניהם תאי אפיתל עדשה (LEC) הם שחקני מפתח. LECs ממוקמים על פני השטח הקדמיים של העדשה והם אחראים על שמירה על שקיפותה, ויסות מאזן המים, והשתתפות בצמיחה ופיתוח העדשה 1,2. LECs הם סוג ייחודי של תאים הממוקמים בחלק הקדמי של העדשה, וממלאים תפקיד קריטי בשמירה על בהירות העדשה ותפקודה על ידי ייצור רציף של סיבי העדשה לאורך כל החיים.
קטרקט מאופיין על ידי עכירות מתקדמת של העדשה, וכתוצאה מכך עיוות ופיזור של אור, המוביל ראייה לקויה 3,4. המנגנונים המדויקים העומדים בבסיס היווצרות הקטרקט הם מורכבים ורב-גורמיים, וכוללים תהליכים תאיים ומולקולריים שונים כגון קרינת UV, נזקי חמצון וסכרור 5,6. LECs נמצאו לתרום באופן משמעותי להתפתחות של קטרקט, מה שהופך אותם מוקד חיוני של מחקר 1,2,7,8,9.
יתר על כן, אחד הנושאים הדחופים ביותר ברפואת עיניים כיום הוא שכיחות גבוהה יחסית של opacification קפסולה אחורית (PCO), הידוע גם בשם קטרקט משני. PCO נותר הסיבוך השכיח ביותר לאחר ניתוח קטרקט, המשפיע על עד 20-40% מהמטופלים המבוגרים ו -100% מהילדים בתוך 5 שנים לאחר הניתוח10. PCO נגרמת בעיקר על ידי LECs שיורית שנותרו בשקית הקופסית לאחר מיצוי קטרקט. תאים אלה עוברים טרנספורמציה פתופיזיולוגית רבת פנים הכוללת לא רק מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) אלא גם התמיינות של LECs לסיבי עדשה, וכתוצאה מכך אוכלוסיית תאים שהיא תערובת של LECs, סיבים ומיופיברובלסטים 11,12,13. התאים שעברו טרנספורמציה מתרבים ונודדים על פני קפסולת העדשה האחורית, מה שמוביל לליקוי ראייה. הבנת ההתנהגות ומנגנוני הבקרה של LECs במודלים של תרבות יכולה לספק תובנות חשובות לגבי מניעה וניהול של PCO. לכן, פרוטוקול זה של טיפוח LECs מציג כלי חיוני לחוקרי עיניים שמטרתם ללמוד, להבין ובסופו של דבר להילחם בסיבוך נפוץ זה לאחר הניתוח.
כדי לפענח את המורכבויות של ביולוגיית LEC ואת תפקידה בהיווצרות קטרקט ו- PCO, חיוני להקים מערכות חזקות וניתנות לשחזור במבחנה של תרביות תאים ראשוניות. תרבית LEC ראשונית מספקת לחוקרים סביבה מבוקרת לחקר הפונקציות, האיתות והמאפיינים המולקולריים של LECs. יתר על כן, הוא מאפשר לחקור תהליכים תאיים ואת ההשפעות של תנאי ניסוי שונים, ומספק תובנות יקרות ערך על הפיזיולוגיה והפתולוגיה של העדשה.
מחקרים קודמים העשירו את הבנתנו של טכניקות תרבות LEC 14,15,16,17,18,19,20. למרות שמחקרים אלה השתמשו במתודולוגיות שונות והניבו ממצאים משמעותיים על התנהגות ומאפייני LEC, פרוטוקול הקלטת וידאו מקיף ונגיש לטיפוח LECs נעדר בספרות הנוכחית. מגבלה זו עלולה לעכב את יכולתם של חוקרים מתחילים לשחזר במדויק את הטכניקות ועלולה להוביל לחוסר עקביות ושינויים בתוצאות הניסוי. על ידי מתן פרוטוקול הקלטת וידאו, מאמר מחקר זה נועד לגשר על פער זה ולספק משאב סטנדרטי שיכול לשפר את יכולת השחזור ולהקל על העברת ידע בתחום תרבות LEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג במאמר זה מספק מדריך מקיף, שלב אחר שלב, לבידוד, תרבות ותת-תרבות מוצלחים של LECs ראשוניים, יחד עם תיעוד וידאו נלווה. המדריך החזותי המפורט לצד ההוראות הכתובות משפר את הבהירות והנגישות של הפרוטוקול, ומקדם את השימוש בו ואת יכולת השחזור שלו בקרב חוקרים בתחום. המטרה הסופית היא לתרום ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NEI R21EY033941 (להונגלי וו); משרד ההגנה W81XWH2010896 (להונגלי וו); R15GM123463-02 (לקיילה גרין והונגלי וו)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture–iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients – association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells – relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. 发育生物学. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
