Оптимизация культуры эпителиальных клеток первичного хрусталика мыши: подробное руководство по трипсинизации
Summary
В этой рукописи описывается подробный видеопротокол культивирования первичных эпителиальных клеток хрусталика (LEC), направленный на улучшение воспроизводимости и помощь в исследованиях катаракты и помутнения задней капсулы (ПКЯ). Он предлагает пошаговые инструкции по препарированию хрусталика, изоляции и валидации LEC, что служит ценным руководством, особенно для новичков в этой области.
Abstract
Эпителиальные клетки хрусталика (LEC) играют несколько важных ролей в поддержании гомеостаза и нормального функционирования хрусталика. LEC определяют рост, развитие, размер и прозрачность хрусталика. И наоборот, дисфункциональные ЛЭК могут привести к образованию катаракты и помутнению задней капсулы (ПКЯ). Следовательно, создание надежной системы первичного культивирования LEC важно для исследователей, занимающихся разработкой хрусталиков, биохимией, терапией катаракты и профилактикой ПКЯ. Тем не менее, культивирование первичных ЛЭК уже давно представляет собой проблему из-за их ограниченной доступности, медленной скорости распространения и деликатного характера.
Данное исследование направлено на устранение этих препятствий путем представления комплексного протокола для первичной культуры LEC. Протокол включает в себя такие важные этапы, как разработка оптимизированной питательной среды, точная изоляция капсул хрусталика, методы трипсинизации, процедуры субкультуры, протоколы сбора урожая и рекомендации по хранению и транспортировке. На протяжении всего процесса культивирования морфологию клеток контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Для подтверждения подлинности культивируемых ЛЭК были проведены иммунофлуоресцентные анализы для выявления наличия и субклеточного распределения критических белков хрусталика, а именно αA- и γ-кристаллинов. Этот подробный протокол предоставляет исследователям ценный ресурс для культивирования и характеристики первичных ЛЭК, что позволяет продвинуться в понимании биологии хрусталика и разработке терапевтических стратегий для расстройств, связанных с хрусталиком.
Introduction
Хрусталик глаза играет решающую роль в зрении, фокусируя входящий свет на сетчатке. Он состоит из прозрачной аваскулярной структуры, состоящей из специализированных клеток, среди которых ключевыми игроками являются эпителиальные клетки хрусталика (LEC). ЛЭК располагаются на передней поверхности хрусталика и отвечают за поддержание его прозрачности, регулирование водного баланса и участие в росте и развитии хрусталика 1,2. LEC — это уникальный тип клеток, расположенных в передней части хрусталика, играющих важнейшую роль в поддержании четкости и функции хрусталика путем непрерывного производства волокон хрусталика на протяжении всей жизни.
Катаракта характеризуется прогрессирующим помутнением хрусталика, что приводит к искажению и рассеянию света, что приводит к ухудшению зрения 3,4. Точные механизмы, лежащие в основе образования катаракты, сложны и многофакторны, включая различные клеточные и молекулярные процессы, такие как ультрафиолетовое излучение, окислительное повреждение и гликирование 5,6. Было обнаружено, что LEC вносят значительный вклад в развитие катаракты, что делает их жизненно важным объектом исследований 1,2,7,8,9.
Кроме того, одной из наиболее актуальных проблем в офтальмологии на сегодняшний день является относительно высокая частота помутнения задней капсулы (СПКЯ), также известной как вторичная катаракта. ПКЯ остается наиболее распространенным осложнением после операции по удалению катаракты, поражая до 20-40% взрослых пациентов и 100% детей в течение 5 лет после операции10. ПКЯ в первую очередь вызывается остаточными ЛЭК, которые остаются в капсульном мешке после экстракции катаракты. Эти клетки претерпевают многогранную патофизиологическую трансформацию, включающую не только эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), но и дифференцировку ЛЭК в волокна хрусталика, в результате чего образуется клеточная популяция, представляющая собой смесь ЛЭК, волокон и миофибробластов 11,12,13. Трансформированные клетки пролиферируют и мигрируют через заднюю капсулу хрусталика, что приводит к ухудшению зрения. Понимание поведения и механизмов контроля LEC в культуральных моделях может дать ценную информацию о профилактике и лечении ПКЯ. Таким образом, этот протокол культивирования LEC представляет собой жизненно важный инструмент для офтальмологических исследователей, стремящихся изучить, понять и, в конечном счете, бороться с этим распространенным послеоперационным осложнением.
Чтобы разобраться в хитросплетениях биологии LEC и ее роли в формировании катаракты и ПКЯ, необходимо создать надежные и воспроизводимые системы первичных клеточных культур in vitro . Первичная культура LEC предоставляет исследователям контролируемую среду для изучения функций, сигнализации и молекулярных характеристик LEC. Кроме того, он позволяет исследовать клеточные процессы и эффекты различных экспериментальных условий, предоставляя ценную информацию о физиологии и патологии хрусталика.
Предыдущие исследования обогатили наше понимание методов культивирования LEC 14,15,16,17,18,19,20. Несмотря на то, что в этих исследованиях использовались различные методологии и были получены важные результаты о поведении и характеристиках LEC, в современной литературе отсутствует всеобъемлющий и доступный протокол видеозаписи для культивирования LEC. Это ограничение может препятствовать способности начинающих исследователей точно воспроизводить методы и может привести к несоответствиям и вариациям в экспериментальных результатах. Предоставляя протокол видеозаписи, данная исследовательская работа направлена на то, чтобы восполнить этот пробел и предоставить стандартизированный ресурс, который может повысить воспроизводимость и облегчить передачу знаний в области культуры LEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленный в этом документе, представляет собой всеобъемлющее, пошаговое руководство по успешной изоляции, культуре и субкультуре первичных LEC, дополненное сопроводительной видеодокументацией. Подробное визуальное руководство вместе с письменными инструкциями повыша?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NEI R21EY033941 (Hongli Wu); Министерство обороны W81XWH2010896 (Хунли Ву); R15GM123463-02 (Кайле Грин и Хунли Ву)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture–iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients – association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells – relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. 发育生物学. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
