وضع العلامات المناعية في أقسام أنسجة الغشاء المخاطي للأنف من فئران التهاب الأنف التحسسي عبر المقايسة المناعية متعددة الألوان
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية التألق المناعي متعدد الألوان لتقييم نموذج الفئران لالتهاب الأنف التحسسي.
Abstract
التهاب الأنف التحسسي (AR) هو مرض التهابي مزمن غير معدي يصيب الغشاء المخاطي للأنف ، ويتوسط فيه في المقام الأول الغلوبولين المناعي المحدد E (IgE) ، ويؤثر على حوالي 10٪ -20٪ من سكان العالم. في حين أن التلوين المناعي (IF) كان منذ فترة طويلة تقنية قياسية للكشف عن تعبير البروتين الخاص بالمرض ، فإن تقنيات IF التقليدية محدودة في قدرتها على اكتشاف مستويات التعبير لثلاثة بروتينات أو أكثر في نفس العينة. وبالتالي ، تم تطوير تقنيات IF متعددة الألوان في السنوات الأخيرة ، والتي تسمح بوضع العلامات المتزامنة لأهداف متعددة في الخلايا أو الأنسجة.
يوفر هذا البروتوكول نظرة عامة شاملة على عملية إنشاء نموذج الفئران من AR ، والحصول على عينات الغشاء المخاطي للأنف ، والإجراءات الفنية للتألق المناعي متعدد الألوان. أظهرت جميع الفئران في مجموعة AR أعراضا نموذجية مثل العطس وسيلان الأنف وحكة الأنف ، مع تسجيل الملاحظات السلوكية ≥5 نقطة. كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) عن زيادة عدد الخلايا الالتهابية وتعطيل سلامة الغشاء المخاطي للأنف في مجموعة AR. أظهر التألق المناعي متعدد الألوان (mIF) زيادة في التعبير عن RORγt و TICAM-1 ، بينما انخفض تعبير Foxp3 في أنسجة الغشاء المخاطي للأنف لفئران AR.
Introduction
التهاب الأنف التحسسي (AR) هو مرض التهابي مزمن غير معدي يصيب الغشاء المخاطي للأنف بوساطة الغلوبولين المناعي المحدد E (IgE) 1,2. يتميز بأعراض مثل العطس وسيلان الأنف واحتقان الأنف وحكة الأنف. مع التصنيع والتحضر ، يتزايد انتشار AR تدريجيا ، مما يؤثر على حوالي 10٪ -20٪ من سكان العالم1. تقنية التألق المناعي (IF) هي طريقة تلطيخ الفلورسنت التي تستخدم تفاعل ربط الأجسام المضادة والمستضد. يمكن استخدامه للكشف عن وقياس مستويات التوزيع والتعبير لبروتينات معينة في الأنسجة أو الخلايا البيولوجية. في أبحاث الواقع المعزز ، يمكن ل IF اكتشاف أهداف متعددة في وقت واحد ، بما في ذلك السيتوكينات المرتبطة بالواقع المعزز ، والخلايا الالتهابية ، والمستقبلات ، وأكثر من ذلك ، مما يسهل استكشاف التسبب في AR وتأثيرات الأدوية3،4،5،6.
تشبه عملية التلوين المناعي متعدد الألوان (mIF) إلى حد كبير IF، مع إضافة خطوة شطف الأجسام المضادة خلال كل جولة من التلطيخ. يتيح هذا التعديل الكشف المتزامن عن المؤشرات الحيوية المتعددة على نفس قسم الأنسجة من خلال وضع العلامات الفردية المتسلسلة وجولات متعددة من إعادة التلطيخ. يعتمد mIF على تضخيم إشارة التيراميد (TSA) ، مما يسمح بدورات متكررة من تلطيخ الفلورسنت TSA واستخدام تسخين الميكروويف لإزالة الأجسام المضادة مع الاحتفاظ بإشارات الفلورسنت 7,8. بالمقارنة مع IF التقليدي ، يقدم mIF العديد من المزايا: (1) يمكنه اكتشاف المستضدات ذات التعبير الضعيف التي يصعب تحديدها مع IF 9,10 التقليدي ؛ (2) يوفر تلطيخا عالي الجودة مع نسبة إشارة إلى ضوضاء محسنة ؛ (3) يسمح بالقياس الكمي للهياكل والمناطق ذات الأهمية الخاصة بالأنسجة11 ؛ (4) تعدد المسارات المتعددة يستخدم الأنسجة بكفاءة ويحافظ على الموارد المرضية المحدودة12 ؛ (5) يقدم التحليل متعدد المعلمات من خلال mIF رؤى أعمق في الأنسجة ، ويكشف عن المعلومات البيولوجية المخفية13.
بشكل عام ، يسمح mIF بمراقبة تعبيرات وتوزيعات المستضد المختلفة داخل نفس العينة ، مما يسهل دراسة البروتينات المستهدفة. في المستقبل ، سيجد الباحثون الذين يسعون إلى فهم التعبير عن البروتينات المستهدفة المتعددة وتوزيعها هذه التقنية خيارا قيما. توضح هذه الدراسة تطبيق mIF لتلطيخ عينات الغشاء المخاطي للأنف من الفئران باستخدام AR وتقييم إنشاء نموذج الفئران من AR.
Protocol
Representative Results
Discussion
التهاب الأنف التحسسي (AR) هو مرض التهابي غير معدي في الغشاء المخاطي للأنف ناتج عن مجموعة من العوامل البيئية والوراثية. لقد أصبح مصدر قلق صحي عالمي ، مما يؤثر على كفاءة العمل ، ويقلل من نوعية الحياة ، ويضعف النوم ، والوظيفة الإدراكية ، ويسبب التهيج والتعب. يؤثر الواقع المعزز على 10٪ -20٪ من سكان …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل إدارة العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة سيتشوان (2021YJ0175).
Materials
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. 癌症研究. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. 癌症研究. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue – a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature reviews. 6 (1), 95 (2020).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. 癌症研究. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. 癌症研究. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
