Marquage immunofluorescent dans des coupes de tissu de muqueuse nasale de rats atteints de rhinite allergique par immunodosage multicolore
Summary
Ce protocole décrit une technique d’immunofluorescence multicolore pour évaluer le modèle de rhinite allergique chez le rat.
Abstract
La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire chronique et non infectieuse de la muqueuse nasale, principalement médiée par des immunoglobulines E (IgE) spécifiques, qui touche environ 10 à 20 % de la population mondiale. Alors que la coloration par immunofluorescence (FI) est depuis longtemps une technique standard pour détecter l’expression de protéines spécifiques à une maladie, les techniques IF conventionnelles sont limitées dans leur capacité à détecter les niveaux d’expression de trois protéines ou plus dans le même échantillon. Par conséquent, des techniques d’IF multicolores ont été développées ces dernières années, qui permettent le marquage simultané de plusieurs cibles dans des cellules ou des tissus.
Ce protocole fournit une vue d’ensemble complète du processus d’établissement d’un modèle d’AR chez le rat, d’obtention d’échantillons de muqueuse nasale et des procédures techniques d’immunofluorescence multicolore. Tous les rats du groupe AR présentaient des symptômes typiques tels que des éternuements, un écoulement nasal et des démangeaisons nasales, les observations comportementales obtenant un score de ≥5 points. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) a révélé une augmentation du nombre de cellules inflammatoires et une perturbation de l’intégrité de la muqueuse nasale dans le groupe AR. L’immunofluorescence multicolore (mIF) a démontré une augmentation de l’expression de RORγt et de TICAM-1, tandis que l’expression de Foxp3 a diminué dans le tissu de la muqueuse nasale des rats AR.
Introduction
La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire chronique et non infectieuse de la muqueuse nasale principalement médiée par des immunoglobulines E (IgE) spécifiques1,2. Elle se caractérise par des symptômes tels que des éternuements, un écoulement nasal, une congestion nasale et des démangeaisons nasales. Avec l’industrialisation et l’urbanisation, la prévalence de la RA augmente progressivement, affectant environ 10 à 20 % de la population mondiale1. La technique d’immunofluorescence (IF) est une méthode de coloration fluorescente qui utilise une réaction de liaison anticorps-antigène. Il peut être utilisé pour détecter et quantifier les niveaux de distribution et d’expression de protéines spécifiques dans les tissus biologiques ou les cellules. Dans la recherche sur la RA, l’IF peut détecter simultanément plusieurs cibles, y compris les cytokines liées à la RA, les cellules inflammatoires, les récepteurs, etc., ce qui facilite l’exploration de la pathogenèse de la RA et des effets des médicaments 3,4,5,6.
Le processus de coloration par immunofluorescence multicolore (mIF) ressemble beaucoup à l’IF traditionnel, avec l’ajout d’une étape d’élution d’anticorps lors de chaque cycle de coloration. Cette modification permet la détection simultanée de plusieurs biomarqueurs sur la même coupe de tissu grâce à un marquage unique séquentiel et à plusieurs cycles de recoloration. mIF est basé sur l’amplification du signal tyramide (TSA), ce qui permet des cycles répétés de coloration fluorescente TSA et l’utilisation du chauffage par micro-ondes pour éliminer les anticorps tout en conservant les signaux fluorescents 7,8. Par rapport à l’IF conventionnelle, la FIm offre plusieurs avantages : (1) elle peut détecter des antigènes faiblement exprimés qui sont difficiles à identifier avec l’IF 9,10 conventionnelle ; (2) il fournit une coloration de haute qualité avec un rapport signal/bruit amélioré ; (3) il permet de quantifier les structures tissulaires spécifiques et les régions d’intérêt11 ; (4) le multiplexage de plusieurs voies utilise efficacement les tissus et préserve les ressources pathologiques limitées12 ; (5) L’analyse multiparamétrique par mIF offre des informations plus approfondies sur les tissus, découvrant des informations biologiques cachées13.
Dans l’ensemble, mIF permet d’observer différentes expressions et distributions d’antigènes au sein d’un même échantillon, facilitant ainsi l’étude des protéines cibles. À l’avenir, les chercheurs qui cherchent à comprendre l’expression et la distribution de plusieurs protéines cibles trouveront dans cette technique un choix précieux. Cette étude démontre l’application de la mIF pour la coloration d’échantillons de muqueuse nasale de rats avec AR et évalue l’établissement d’un modèle d’AR chez le rat.
Protocol
Representative Results
Discussion
La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire non infectieuse de la muqueuse nasale résultant d’une combinaison de facteurs environnementaux et génétiques. Il est devenu un problème de santé mondial, ayant un impact sur l’efficacité au travail, diminuant la qualité de vie, altérant le sommeil, les fonctions cognitives et provoquant de l’irritabilité et de la fatigue. La réalité augmentée touche 10 à 20 % de la population mondiale¹ et entraîne des coûts économiques considérables, causant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par le Département provincial de la science et de la technologie du Sichuan (2021YJ0175).
Materials
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
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