Multicolor Immunoassay를 통한 알레르기 비염 쥐의 코 점막 조직 절편에서 면역형광 라벨링
Summary
이 프로토콜은 알레르기 비염의 쥐 모델을 평가하기 위한 다색 면역형광 기법을 설명합니다.
Abstract
알레르기 비염(AR)은 주로 특정 면역글로불린 E(IgE)에 의해 매개되는 코 점막의 만성 비감염성 염증성 질환으로, 전 세계 인구의 약 10%-20%에 영향을 미칩니다. 면역형광(IF) 염색은 오랫동안 질병 특이적 단백질 발현을 검출하기 위한 표준 기법이었지만, 기존의 IF 기법은 동일한 샘플에서 3개 이상의 단백질 발현 수준을 검출하는 데 한계가 있습니다. 그 결과, 최근 몇 년 동안 세포 또는 조직에서 여러 표적을 동시에 라벨링할 수 있는 다색 IF 기술이 개발되었습니다.
이 프로토콜은 AR의 쥐 모델을 확립하고, 비강 점막 샘플을 얻고, 다색 면역형광을 위한 기술 절차를 위한 프로세스에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다. AR 그룹의 모든 쥐는 재채기, 콧물, 코 가려움증과 같은 전형적인 증상을 보였으며 행동 관찰에서 ≥5점을 받았습니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 결과 AR 그룹에서 염증 세포 수가 증가하고 코 점막 무결성이 손상되었습니다. 다색 면역형광(mIF)은 AR 쥐의 코 점막 조직에서 RORγt 및 TICAM-1의 발현이 증가한 반면 Foxp3 발현은 감소한 것으로 나타났습니다.
Introduction
알레르기 비염(AR)은 주로 특정 면역글로불린 E(IgE)에 의해 매개되는 코 점막의 만성 비감염성 염증성 질환입니다1,2. 재채기, 콧물, 코막힘, 코 가려움증 등의 증상이 특징입니다. 산업화와 도시화로 AR의 보급률이 점차 증가하여 세계 인구의 약 10%-20%에 영향을 미치고 있습니다1. 면역형광(IF) 기법은 항체-항원 결합 반응을 활용하는 형광 염색 방법입니다. 생물학적 조직 또는 세포에서 특정 단백질의 분포 및 발현 수준을 감지하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. AR 연구에서 IF는 AR 관련 사이토카인, 염증 세포, 수용체 등을 포함한 여러 표적을 동시에 검출할 수 있어 AR 발병 기전 및 약물의 효과 탐색을 용이하게 합니다 3,4,5,6.
다색 면역형광(mIF) 염색 공정은 기존 IF와 매우 유사하며, 각 염색 라운드마다 항체 용출 단계가 추가됩니다. 이 변형을 통해 순차적인 단일 라벨링 및 여러 차례의 재염색을 통해 동일한 조직 절편에서 여러 바이오마커를 동시에 검출할 수 있습니다. mIF는 티라미드 신호 증폭(TSA)을 기반으로 하며, 형광 신호 7,8을 유지하면서 TSA 형광 염색 및 마이크로파 가열을 사용하여 항체를 제거하는 반복적인 주기를 허용합니다. 기존의 IF와 비교하여, mIF는 다음과 같은 몇 가지 장점을 제공합니다: (1) 기존의 IF 9,10으로 식별하기 어려운 약하게 발현된 항원을 검출할 수 있습니다. (2) 향상된 신호 대 잡음비로 고품질 염색을 제공합니다. (3) 조직 특이적 구조 및 관심 영역(11)을 정량화할 수 있다. (4) 다중 경로를 다중화하여 조직을 효율적으로 활용하고 제한된 병리학적 자원을 보존한다12; (5) mIF를 통한 다중 파라미터 분석은 조직에 대한 심층적인 통찰력을 제공하여 숨겨진 생물학적 정보를 밝혀냅니다13.
전반적으로 mIF를 사용하면 동일한 샘플 내에서 다양한 항원 발현 및 분포를 관찰할 수 있어 표적 단백질 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 앞으로 여러 표적 단백질의 발현과 분포를 이해하고자 하는 연구자들은 이 기술이 가치 있는 선택이라는 것을 알게 될 것입니다. 이 연구는 AR로 쥐의 코 점막 샘플을 염색하기 위한 mIF의 적용을 보여주고 AR의 쥐 모델 확립을 평가합니다.
Protocol
실험 프로토콜 및 절차는 청두 중국 전통 의학 대학 행정 및 동물 연구 위원회의 승인을 받았습니다(기록 번호: 2022DL-010). 무게가 180-200g인 8주 된 수컷 Sprague Dawley(SD) 쥐를 상업적으로 획득하여( 재료 표 참조) 온도(23 ± 2°C) 및 상대 습도(55% ± 10%)를 제어하여 자연광/어두움 주기에 보관했습니다. 12마리의 쥐를 무작위로 대조군과 AR군의 두 그룹으로 나눴다. 모든 쥐는 이러한 조건에 적?…
Representative Results
6마리의 SD 쥐를 OVA 복강 내 주사 및 비강 챌린지를 통해 AR 모델에 성공적으로 유도했습니다. AR은 AR 그룹의 모든 쥐에서 유도되었으며, 그룹의 100%를 차지했습니다. AR 그룹의 모든 쥐는 재채기, 콧물, 코 가려움증과 같은 전형적인 증상을 보였습니다. 모든 행동 관찰은 ≥5점을 기록했다(표 2). 모델링 21일 째 H&E 염색 결과, 대조군 쥐에서 코 점막의 상피세?…
Discussion
알레르기 비염(AR)은 환경적 요인과 유전적 요인이 복합적으로 작용하여 발생하는 비감염성 비점막 염증성 질환입니다. 이는 업무 효율성에 영향을 미치고, 삶의 질을 떨어뜨리고, 수면, 인지 기능을 손상시키고, 과민성과 피로를 유발하는 세계적인 건강 문제가 되었습니다. AR은 전 세계 인구의 10%-20%에 영향을 미치며¹ 상당한 경제적 비용을 수반하여 EU 국가에서 연간 최대 30-500억 유로의 손실을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 쓰촨성 과학기술부(2021YJ0175)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
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Cite This Article
Hu, Y., Luo, H., Li, J., Zhang, R., Fu, L., Ren, Q., Chen, Y., Huang, X., Zhou, Z., Yuan, H., Tian, L., Wang, X. Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay. J. Vis. Exp. (199), e65937, doi:10.3791/65937 (2023).