Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines
Summary
Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules souches embryonnaires humaines peuvent être analysées à l'aide des tests d'activité de gel.
Abstract
Les mitochondries sont des organites cytoplasmiques qui ont un rôle primordial dans le métabolisme cellulaire et l'homéostasie, la régulation du réseau de signalisation cellulaire, et la mort cellulaire programmée. Les mitochondries produisent l'ATP, de réglementer l'état redox cytoplasmique et Ca2 + bilan, cataboliser acides gras, de synthétiser l'hème, nucléotides, hormones stéroïdes, acides aminés, et aider à assembler fer-soufre dans les protéines. Les mitochondries jouent également un rôle essentiel dans la production de chaleur. Les mutations du génome mitochondrial entraîner plusieurs types de trouble humain. L'accumulation de mutations de l'ADNmt est en corrélation avec le vieillissement et est soupçonné d'avoir un rôle important dans le développement du cancer. En raison de leur rôle d'une importance vitale dans tous les types de cellules, la fonction des mitochondries doit aussi être critique pour les cellules souches. Avancées majeures ont été faites dans notre compréhension de la viabilité des cellules souches, la prolifération, et la capacité de différenciation. Mais l'activité fonctionnelle des cellules souches, en particulier de leur état énergétique, ne fut pas encore été étudiés en détail. Presque rien n'est connu sur les propriétés des mitochondries des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et leur descendance différenciée précurseur. Une façon de comprendre et d'évaluer le rôle des mitochondries dans la fonction de CSEh et le potentiel de développement est de mesurer directement l'activité des complexes respiratoires mitochondriaux. Ici, nous décrivons haute résolution électrophorèse sur gel natif claires et les suivants dans la visualisation de l'activité de gel comme une méthode pour analyser les cinq complexes de la chaîne respiratoire des CSEh.
Protocol
Discussion
Dans cette vidéo, nous avons décrit l'extraction des complexes de protéines mitochondriales de cellules souches embryonnaires humaines, leur séparation par électrophorèse haute résolution claire gel natif (hrCNE), et l'analyse subséquente par en gel des essais d'activité catalytique. hrCNE résout mitochondriale des complexes protéine membranaire à une résolution comparable à celle de l'électrophorèse sur gel bleu natif et est supérieure pour les tests d'activité dans le gel. Cette technique peut être e…
Acknowledgements
Embryonnaires humaines études de cellules souches dans le laboratoire Teitell sont actuellement pris en charge par une California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Subvention de démarrage RS1-00313. Nous remercions le Dr Carla Koehler (UCLA) et des membres du laboratoire Koehler de fournir des conseils et des idées dans ces domaines et des études supplémentaires.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH | |
| 1M NaCl | Sigma | S3014-500MG | ||
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | ||
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C | |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD | 9010 | store at 4 C | |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma | I-2399 | store at 4 C | |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | ||
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. | |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. | |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C | |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. | |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. | |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. | |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | ||
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | ||
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | ||
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | ||
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma | A2383-5G | Grade I, minimum 99% | |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma | N-8129 | ||
| Cytochrome c From horse heart | Sigma | C2506-250MG | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | ||
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Store at – 20 C. | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | ||
| Trypan blue Stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | ||
| 10x Trypsin (0.5%) | Gibco | 15400-054 | ||
| Trypsin Inhibitor | Gibco | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D., Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. 4.2, 4.2.1-4.2.57 (2007).
