İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı
Summary
Bu video, insan embriyonik kök hücreleri mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri jel faaliyet deneyleri kullanarak nasıl analiz edilebilir size gösterecektir.
Abstract
Mitokondri, sitoplazma, hücre metabolizması ve homeostasis birincil rolü var organelleri, hücre sinyal ağının düzenlenmesi, ve programlı hücre ölümü. Mitokondri üretmek ATP, sitoplazmik redoks devlet ve Ca2 + dengesini düzenleyen yağ asitleri catabolize, hem, nükleotidler, steroid hormonlar, amino asitler, sentez ve proteinlerin demir-kükürt kümeleri bir araya yardımcı. Mitokondri, aynı zamanda ısı üretimi önemli bir rolü var. Mitokondriyal genom mutasyonları insan bozukluğunun çeşitli neden olur. MtDNA mutasyonlarının birikmesi, yaşlanma ile ilişkilidir ve kanser gelişiminde önemli bir role sahip şüphelenilen. Tüm hücre tipleri hayati önemli rol nedeniyle, mitokondri fonksiyonu da kök hücreler için kritik öneme sahip olmalıdır. Kök hücre canlılığı, proliferasyon ve farklılaşma kapasitesi anlayışımızın önemli ilerlemeler yapılmıştır. Ancak kök hücrelerin fonksiyonel aktivite, özellikle enerji durumu, henüz detaylı bir şekilde incelenmemiştir değildi. Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve farklılaştırılmış habercisi döl mitokondriyal özellikleri hakkında neredeyse hiçbir şey bilinir. HESC işlev ve gelişim potansiyeli mitokondri rolünü anlamak ve değerlendirmek için tek yolu doğrudan mitokondriyal solunum kompleksleri aktivitesini ölçmek için. Burada, yüksek çözünürlüklü hESC beş solunum zinciri kompleksleri analiz etmek için bir yöntem olarak jel faaliyet görselleştirme net yerli jel elektroforezi ve sonraki açıklar.
Protocol
Discussion
Bu video, insan embriyonik kök hücreleri, yüksek çözünürlükte net yerli jel elektroforezi (hrCNE) ayrılması, ve jel katalitik etkinlik analizleri ile sonraki analiz mitokondriyal protein kompleksleri çıkarma tarif ettiler. hrCNE mavi yerel jel elektroforezi ile karşılaştırılabilir bir çözünürlükte mitokondrial membran protein kompleksleri giderir ve jel faaliyet deneyleri için üstündür. Bu teknik, mitokondriyal solunum kompleksleri IV ölçmek için değil, aynı zamanda hESC ve bunların türev döl hem de herhang…
Acknowledgements
Teitell laboratuvar İnsan embriyonik kök hücre çalışmaları henüz California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) tohum hibe RS1-00313 tarafından desteklenmektedir. Biz bu ve ek çalışmalar tavsiye ve anlayışlar sağlamak için Dr. Carla Köhler (UCLA) ve Köhler, laboratuvar üyelerine teşekkür ederim.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH | |
| 1M NaCl | Sigma | S3014-500MG | ||
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | ||
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C | |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD | 9010 | store at 4 C | |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma | I-2399 | store at 4 C | |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | ||
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. | |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. | |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C | |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. | |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. | |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. | |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | ||
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | ||
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | ||
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | ||
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma | A2383-5G | Grade I, minimum 99% | |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma | N-8129 | ||
| Cytochrome c From horse heart | Sigma | C2506-250MG | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | ||
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Store at – 20 C. | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | ||
| Trypan blue Stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | ||
| 10x Trypsin (0.5%) | Gibco | 15400-054 | ||
| Trypsin Inhibitor | Gibco | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D., Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. 4.2, 4.2.1-4.2.57 (2007).
