בסרטון הזה, אנו יראה לכם כיצד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה קומפלקסים של בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות נותחו באמצעות מבחני פעילות ג'ל.
Abstract
המיטוכונדריה הם אברונים cytoplasmic שיש להם תפקיד מרכזי במטבוליזם הומאוסטזיס הסלולר, הרגולציה של הרשת התא איתות, ועל מוות תאים מתוכנת. המיטוכונדריה לייצר ATP, להסדיר את המדינה חמזור cytoplasmic ו Ca2 + איזון, catabolize חומצות שומן, לסנתז heme, נוקלאוטידים, הורמונים סטרואידים, חומצות אמינו, לעזור להרכיב ברזל גופרית אשכולות בחלבונים. המיטוכונדריה יש גם תפקיד חיוני בייצור חום. מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי הגורם מספר סוגים של ההפרעה האנושית. הצטברות של מוטציות mtDNA בקורלציה עם הזדקנות חשוד יש תפקיד חשוב בהתפתחות סרטן. בשל תפקיד חשוב ביותר שלהם בכל סוגי תאים, הפונקציה של המיטוכונדריה חייב גם להיות קריטי עבור בתאי גזע. ההתקדמות מפתח נעשו הבנתנו הכדאיות גזע תאים, התפשטות, ויכולת הבחנה. אבל את הפעילות התפקודית של בתאי גזע, מעמד מסוים האנרגיה שלהם, עדיין לא נחקרו בפירוט. כמעט דבר אינו ידוע על המאפיינים של המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) והצאצאים שלהם מבשר מובחן. אחת הדרכים להבין ולהעריך את התפקיד של המיטוכונדריה בתפקוד hESC ואת הפוטנציאל ההתפתחותי היא למדוד ישירות את הפעילות של מתחמי הנשימה במיטוכונדריה. כאן אנו מתארים ברזולוציה גבוהה ברור יליד ג'ל אלקטרופורזה ובעקבות ב להדמיה ג'ל הפעילות כשיטה לניתוח חמשת מתחמי שרשרת הנשימה של hESCs.
Protocol
רזולוציה גבוהה נקה Native ג'ל Electophoresis (hrCNE) עבור קומפלקס מיטוכונדריאלי In-Gel פעילות מבחני בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נשמרו על monolayer של C-שטופלו fibroblasts ˠ מוקרן או mitomycin עכבר עובריים (MEFs), אחר כך עברו על צמיחה Matrigel במשך 5 ימים במדיום MEF ממ?…
Discussion
בסרטון הזה, שתיארנו החילוץ של קומפלקסים חלבונים מן המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים, הפרדה שלהם על ידי אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה ברור ג'ל יליד (hrCNE), וכן על ידי ניתוח לאחר מכן ב-ג'ל מבחני פעילות קטליטית. hrCNE פותר המיטוכונדריה חלבון מתחמי ממברנה ברזולוציה דומה לזה של כח?…
Acknowledgements
האדם מחקרים בתאי גזע עובריים במעבדה Teitell נתמכים כיום על ידי המכון לרפואה בקליפורניה הרגנרציה (CIRM) זרע מענק RS1-00313. אנו מודים לד"ר קרלה קוהלר (UCLA) ואנשי מעבדה קוהלר למתן עצות ותובנות אלה ומחקרים נוספים.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
0.5M EDTA
Fisher Scientific
BP120-1
adjust pH to 8.0 with NaOH
1M NaCl
Sigma
S3014-500MG
1M Sodium succinate
Fisher Scientific
S413-500
0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2
Fisher Scientific
BP332-1 and BP329-1
Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C
1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH)
EMD
9010
store at 4 C
1M imidazole/HCl, pH 7.0
Sigma
I-2399
store at 4 C
1M Tris-HCl, pH 7.4
Fisher Scientific
BP153-1
20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)
Fluka
44205-500MG
Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C.
10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization)
Fluka
37008-1G
Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use.
2M 6-aminohexanoic acid
Fluka
07260-100G
store at 4 C
10x Ponceau S/glycerol stock solution
Sigma
P-3504 and G6279-1L
0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water.
10% w/v sodium deoxycholate
Fluka
30970-25G
Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature.
250 mM phenazine methasulfate (PMS)
TCI America
P0083
Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C.
Nitro-blue tetrazolium (NBT)
Amresco
0329-1G
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)
TCI America
D0078
Pb(NO3)2
Fisher Scientific
L62-100
MgSO4
Fisher Scientific
BP213-1
Tris base
Fisher Scientific
BP152-10
Glycine
Fisher Scientific
G45-212
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP)
Sigma
A2383-5G
Grade I, minimum 99%
beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form
Khvorostov, I., Zhang, J., Teitell, M. Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (16), e724, doi:10.3791/724 (2008).