Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane
Summary
In questo video vi mostreremo come il complesso della catena respiratoria mitocondriale di cellule staminali embrionali umane possono essere analizzati utilizzando nelle prove di attività gel.
Abstract
I mitocondri sono organelli citoplasmatici che hanno un ruolo primario nel metabolismo cellulare e l'omeostasi, la regolamentazione della rete di segnalazione cellulare, e la morte cellulare programmata. I mitocondri producono ATP, regolare lo stato redox citoplasmatico e Ca2 + equilibrio, catabolizzare acidi grassi, sintesi dell'eme, nucleotidi, ormoni steroidi, amminoacidi, e aiutare assemblare ferro-zolfo in proteine. I mitocondri hanno anche un ruolo essenziale nella produzione di calore. Le mutazioni del genoma mitocondriale causa diversi tipi di disturbo umano. L'accumulo di mutazioni del mtDNA è correlata con l'invecchiamento e si sospetta di avere un ruolo importante nello sviluppo del cancro. Grazie al loro ruolo di vitale importanza in tutti i tipi di cellule, la funzione dei mitocondri devono anche essere critico per le cellule staminali. Progressi fondamentali sono stati fatti nella comprensione della vitalità delle cellule staminali, proliferazione, e la capacità di differenziazione. Ma l'attività funzionale delle cellule staminali, in particolare il loro stato di energia, non era ancora stato studiato in dettaglio. Quasi nulla si sa circa le proprietà mitocondriale di cellule staminali embrionali umane (hESC) e la loro progenie precursore differenziata. Un modo per comprendere e valutare il ruolo dei mitocondri nella funzione hESC e potenziale di sviluppo è quello di misurare direttamente l'attività dei complessi respiratori mitocondriali. Qui, descriviamo alta elettroforesi su gel chiaro risoluzione nativa e la successiva visualizzazione in attività di gel come un metodo per analizzare i cinque complessi della catena respiratoria di hESC.
Protocol
Discussion
In questo video, che abbiamo descritto l'estrazione di complessi proteici mitocondriali di cellule staminali embrionali umane, la loro separazione da alte elettroforesi su gel chiaro risoluzione nativa (hrCNE), e la successiva analisi di in-gel saggi di attività catalitica. hrCNE risolve complessi proteici della membrana mitocondriale con una risoluzione paragonabile a quella di blu elettroforesi su gel nativi ed è superiore per in-gel prove di attività. Questa tecnica può essere utilizzato non solo per quantificare respiratoria mit…
Acknowledgements
Embrionali umane studi sulle cellule staminali in laboratorio Teitell sono attualmente supportati da un Istituto della California per medicina rigeneratrice (CIRM) sementi concedere RS1-00313. Ringraziamo il Dott. Carla Koehler (UCLA) e membri del laboratorio Koehler per fornire consigli e approfondimenti in questi e altri studi.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH | |
| 1M NaCl | Sigma | S3014-500MG | ||
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | ||
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C | |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD | 9010 | store at 4 C | |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma | I-2399 | store at 4 C | |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | ||
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. | |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. | |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C | |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. | |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. | |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. | |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | ||
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | ||
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | ||
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | ||
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma | A2383-5G | Grade I, minimum 99% | |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma | N-8129 | ||
| Cytochrome c From horse heart | Sigma | C2506-250MG | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | ||
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Store at – 20 C. | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | ||
| Trypan blue Stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | ||
| 10x Trypsin (0.5%) | Gibco | 15400-054 | ||
| Trypsin Inhibitor | Gibco | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D., Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. 4.2, 4.2.1-4.2.57 (2007).
