Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도
Summary
이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.
Abstract
줄기 세포가 수있는 능력을 가진 세포로 정의 모두 자기 갱신 여러 차별 자손을 생성합니다. 배아 줄기 세포 (ESC)은 초기 배아의 blastocyst에서 파생된 및 differentiative 능력 pluripotent입니다. 그들의 광대한 differentiative 가능성들을 임상적으로 유용한 세포 유형을 생성하기 위해 그들을 동축 케이블하는 방법 deducing을 중심으로 많은 연구의 초점이되었다. 마우스 ESC에서 조혈 줄기 세포 (HSC)의 성공적인 유도가 최근 완성되었으며이 비디오 프로토콜의 시각하실 수 있습니다. HSC, 거의 틀림없이 가장 임상적으로 악용 세포 인구는 조혈 malignancies 및 장애의 무수한를 치료하는 데 사용됩니다. 그러나, HSC 치료 혜택을 누릴 수 많은 환자가 적합한 기증자에 대한 액세스를 부족합니다. ESC는 이러한 환자 HSC의 대체 소스를 제공할 수. 다음 프로토콜은 ESC – HSC이 공부하고 인간 ESC에서 HSC를 격리하는 노력을 알려 될 수있는 기준을 설정합니다. 이 프로토콜에서는 ESC가 상용 혈청 사전 검사를 최적의 조혈 차별화 6 일 동안 embryoid 기관 (EBS)로 구별됩니다. EBS 다음 dissociated과 retroviral HoxB4에 감염됩니다. 마우스, 그리고 열흘 동안 크린 시토킨를 추진하고 조혈의 존재 공동 교양 – 감염된 EB – 파생 전지 OP9 기질, M – CSF – /의 calvaria에서 파생된 골수 stromal 세포 라인에 도금입니다. 이 공동의 문화 중에 감염된 세포는 세대 세포의 수백만의 100s의 이기종 수영장 결과 크게 확장합니다. 이러한 전지는 다음 구조와 reconstitute lethally 조사 마우스로 사용할 수 있습니다.
Protocol
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
