Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

Summary

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Abstract

Uma célula-tronco é definida como uma célula com capacidade para tanto se auto-renovar e gerar descendência diferenciada múltiplas. Células-tronco embrionárias (ESC) são derivadas do blastocisto do embrião e são pluripotentes na capacidade differentiative. Seu potencial differentiative vasta fez-lhes o foco de muita pesquisa centrada na deduzir como persuadi-los para gerar tipos de células clinicamente útil. A derivação bem-sucedida de células-tronco hematopoiéticas (HSC) de rato ESC foi recentemente realizado e pode ser visualizado neste protocolo de vídeo. HSC, sem dúvida, a população de células clinicamente mais explorados, são usados ​​para tratar uma miríade de malignidades hematopoiéticas e distúrbios. No entanto, muitos pacientes que poderiam se beneficiar da terapia HSC não tem acesso a doadores compatíveis. ESC poderiam fornecer uma fonte alternativa de HSC para estes pacientes. O protocolo a seguir estabelece uma linha de base a partir da qual ESC-HSC podem ser estudados e informar os esforços para isolar HSC da ESC humana. Neste protocolo, ESC são diferenciados como corpos embrióides (EBs) por 6 dias disponíveis comercialmente soro pré-selecionados para a diferenciação ótima hematopoiéticas. EBs são, então, dissociado e infectados com HoxB4 retroviral. Infectados EB células derivadas são semeadas em OP9 estroma, uma linhagem de células de medula óssea estromal derivado da calvária de /-M-CSF – ratos, e co-cultivados na presença de hematopoiese promover citocinas por dez dias. Durante este co-cultura, as células infectadas expandir muito, resultando na geração de uma piscina heterogêneo de 100s de milhões de células. Estas células podem então ser usados ​​para resgatar e reconstituir camundongos letalmente irradiados.

Protocol

Diferenciação de células-tronco embrionárias Coletar um frasco perto confluentes de células-tronco embrionárias (ESC), através de tratamento com tripsina ESC. Ressuspender as células em 5 mL de mídia Diferenciação e transferir para um T25 não-revestido de gelatina. Incubar a 37 ° C por 45 minutos. Recuperar o sobrenadante e coletar células através de centrifugação. Nota: fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) das culturas ESC anexar prontamente aos T25 não-revest…

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invtrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma	H2126	freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma	P3369	8 ug/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc