Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi
Summary
Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.
Abstract
Bir kök hücre kapasitesine sahip bir hücre olarak tanımlanan, hem kendini yenilemek ve birden fazla farklılaşmış döl oluşturmak. Embriyonik kök hücreler (ESC), erken embriyo blastosist türetilmiştir ve pluripotent differentiative yeteneği vardır. Onların engin differentiative potansiyel klinik olarak yararlı bir hücre türleri oluşturmak için onları nasıl ikna edebilmeyi çözmekten merkezli birçok araştırmanın odak yaptı. Fare ESC hematopoietik kök hücrelerin (HSC) başarılı türetme tamamlanmıştır ve bu video protokolde görüntülendi olabilir. HSC, tartışmasız en çok klinik istismar hücre popülasyonu, hematopoetik maligniteler ve bozukluklar sayısız tedavi etmek için kullanılır. Bununla birlikte, birçok hastada HSC tedaviden yarar olabilir uygun donör erişim yoksundur. ESC, bu hastalar için HSC alternatif bir kaynak sağlayabilir. Aşağıdaki protokol ESC-HSC okudu ve insan ESC HSC izole etmek için çabalar bilgilendirmek edilebileceği bir temel kurar. Bu protokol, ESC, piyasada bulunan serum ön elemeden optimal hematopoetik farklılaşma 6 gün embriyoid organları (EBS) olarak ayırt edilirler. EBS sonra ayrışmış ve retroviral HoxB4 ile enfekte. Fare ve ortak kültür varlığı on gün sitokinler teşvik hematopoez – Enfekte EB-elde edilen hücreler, M-CSF / calvaria türetilmiş bir kemik iliği stromal hücre hattı OP9 stroma kaplanmıştır. Bu ko-kültür sırasında, enfekte olan hücreleri nesil 100'ün üzerinde milyonlarca hücreden heterojen bir havuz, büyük ölçüde genişletmek. Bu hücreler daha sonra kurtarma ve sulandırmak ölümcül ışınlanmış fareler için kullanılabilir.
Protocol
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
