Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

Summary

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Abstract

Una célula madre se define como una celda con la capacidad de los auto-renovación y generar progenie diferenciada múltiples. Las células madre embrionarias (ESC) se derivan del blastocisto del embrión temprano y son pluripotentes en la capacidad de diferenciación. Su potencial de diferenciación amplia ha convertido en el foco de muchas investigaciones se centraron en deducir cómo persuadirlos para generar tipos celulares de utilidad clínica. La derivación con éxito de células madre hematopoyéticas (HSC) de la ESC de ratón ha sido recientemente realizado y se puede visualizar en este protocolo de vídeo. HSC, podría decirse que la población clínicamente más explotadas de células, se utilizan para tratar una gran variedad de cánceres hematopoyéticos y trastornos. Sin embargo, muchos pacientes que podrían beneficiarse de la terapia de HSC no tienen acceso a los donantes adecuados. ESC podría proporcionar una fuente alternativa de células madre hematopoyéticas para estos pacientes. El siguiente protocolo establece una línea de base que ESC-HSC puede estudiar e informar a los esfuerzos para aislar a HSC de humano ESC. En este protocolo, el CES se diferencian como cuerpos embrioides (EBS) durante 6 días en suero disponible en el mercado pre-seleccionados para la diferenciación hematopoyética óptima. EBs luego se disocia y se infectaron con HOXB4 retroviral. Infectados procedentes EB-células son colocadas en OP9 estroma, una línea de células del estroma de médula ósea derivada de la bóveda craneal de M-CSF-/ – ratones, y co-cultivadas en presencia de la hematopoyesis la promoción de las citoquinas durante diez días. Durante este co-cultivo, las células infectadas ampliar en gran medida, lo que resulta en la generación de un grupo heterogéneo de 100s de millones de células. Estas células se pueden utilizar para rescatar a los ratones irradiados letalmente y reconstituir.

Protocol

La diferenciación de células madre embrionarias Recoger un frasco de cerca confluente de células madre embrionarias (ESC) a través de un tratamiento con tripsina ESC. Resuspender las células en 5 ml de medio de diferenciación y de traslado a un T25 recubierto de gelatina. Se incuba a 37 ° C durante 45 minutos. Recuperar el sobrenadante y recoger las células por centrifugación. Nota: fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de las culturas ESC conectar fácilmente a la T25 …

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invtrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma	H2126	freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma	P3369	8 ug/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc