الكشف عن سرطان الجلد باستخدام المعدلات اسماك الزرد الموديل ورم الأصليين
Summary
ويقدم وسيلة سريعة للكشف عن سرطان الجلد باستخدام معدلات الزرد نموذج الورم الأصليين. فإنه يستفيد من ناقلات miniCoopR الذي يسمح للتعبير عن الجينات المرشحة سرطان الجلد في الخلايا الصباغية. يتم وصف طريقة للحصول على منحنيات البقاء على قيد الحياة خالية من سرطان الجلد، ومقايسة الغزو، بروتوكول للتلوين الأجسام المضادة الخلايا الصباغية نطاق وفحص زرع سرطان الجلد.
Abstract
وقد أسفرت دراسات الجينية من السرطانات البشرية ثروة من المعلومات حول الجينات التي تتغير في الأورام 1،2،3. وثمة تحد الناشئة عن هذه الدراسات هو أن يتم تغيير العديد من الجينات، وأنه يمكن أن يكون من الصعب التمييز تغيرات جينية تكون الأورام التي دفعت من تلك التي نشأت بالمناسبة خلال التحول. لرسم هذا التمييز فإنه من المفيد أن يكون هناك مقايسة التي يمكن قياس كميا تأثير جين متغير على بدء الورم وغيرها من العمليات التي تمكن الأورام أن تستمر ونشر. هنا نقدم وسيلة سريعة لفحص أعداد كبيرة من معدلات سرطان الجلد مرشح في الزرد باستخدام نموذج الورم الأصليين 4 أن يشمل الخطوات المطلوبة لبدء سرطان الجلد والصيانة. A كاشف رئيسي في هذا الاختبار هو متجه miniCoopR، الذي أزواج نسخة من النوع البري من مواصفات mitfa عامل الخلايا الصباغية إلى عبارة كاسيت إعادة التركيب في أي من المرشحين ميلويمكن إعادة تجميع الجينات أنوما 5. الناقل miniCoopR لديه minigene الإنقاذ mitfa الذي يحتوي على المروج، فتح الإطار القراءة و3'-غير مترجمة المنطقة من الجين mitfa من النوع البري. لأنها تتيح لنا لجعل البنى باستخدام كامل طول إطارات القراءة المفتوحة للمعدلات سرطان الجلد مرشح. ويمكن بعد هذه الحيوانات المستنسخة الفردية يتم حقنها في تيراغرام خلية واحدة (mitfa: BRAF V600E)؛ P53 (LF)؛ الأجنة الزرد mitfa (LF). يحصل دمج ناقلات miniCoopR من Tol2 بوساطة transgenesis 6 و ينقذ الخلايا الصباغية. لأن تقترن ماديا إلى minigene الإنقاذ mitfa، يتم التعبير عن الجينات المرشحة في الخلايا الصباغية انقاذ، والبعض منها سوف تتطور الى تحويل والأورام. ويمكن قياس تأثير الجين مرشح على بدء سرطان الجلد القتامي الخلية وخصائص منحنيات البقاء على قيد الحياة سرطان الجلد باستخدام خالية من المقايسات غزو، وتلطيخ الأجسام المضادة وفحوصات الزرع.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة miniCoopR تمكن التعبير عن الجينات ذات الأهمية في الخلايا الصباغية الزرد. هذا النهج يستفيد من حقيقة أن هذا الجين يعمل الزرد mitfa الخلايا بشكل مستقل. لهذا السبب، الخلايا الصباغية انقاذهم من قبل الناقل miniCoopR من المؤكد أن تحتوي على الجينات أي minigene والاهتمام الذي يقت…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ليونارد I. زون في المختبر الذي تم تطوير هذه التقنيات في البداية؛ كوان كريستين والراحل تشي شين بن لهدايا من البلازميدات المستخدمة في هذا العمل؛ جيمس معلن Raible ديفيد للمساعدة في تلوين الأجسام المضادة، وجيمس لNeiswender وحقن مكروي الفيديو. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R00AR056899-03 لCJC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
Referenzen
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
