ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング
Summary
ゼブラフィッシュ土着腫瘍モデルを用いてメラノーマ修飾するための画面への迅速な方法が提示される。これは、メラノサイト内の候補メラノーマの遺伝子の発現を可能にminiCoopRベクトルを利用しています。メラノーマフリー生存曲線、浸潤アッセイ、スケールメラノサイトおよびメラノーマ移植アッセイの抗体染色のためのプロトコルを取得するための方法が記載されている。
Abstract
ヒト癌のゲノム研究は、腫瘍1,2,3で変更されている遺伝子に関する豊富な情報が得られている。これらの研究から生じる課題は、多くの遺伝子が改変されていることであり、それは、変換時に偶然に生じたものから、腫瘍形成を運転した遺伝的変化を区別するのが困難な場合があります。この区別を描画するには、それを定量的に腫瘍の開始と腫瘍が持続し、普及することができ、他のプロセスで変更された遺伝子の効果を測定できるアッセイを有することが有益である。ここでは、黒色腫の開始と維持のために必要なステップを包含土着腫瘍モデル4を用いてゼブラフィッシュにおける候補メラノーマモディファイ多数を上映するために迅速な手段を提示する。このアッセイにおけるキー試薬がminiCoopRベクトルであり、その中に候補メルGateway組換えカセットに結合mitfaメラノサイト仕様因子の野生型コピーをanoma遺伝子は5を再結合することができる。 miniCoopRベクターは、プロモーター、オープンリーディングフレームと野生型mitfa遺伝子の 3'-非翻訳領域を含むmitfaの救出ミニ遺伝子を持っています。それは私たちが候補メラノーマ修飾子の完全長のオープンリーディングフレームを使用して構造体を作ることができます。 P53（LF）;; mitfa（LF）ゼブラフィッシュの胚：これらの個々のクローンは、単一セルのTg（BRAF V600E mitfa）に注入することができる。 miniCoopRベクトルは Tol2媒介形質転換6によって統合取得し、メラノサイトを救う。それらは物理的にmitfa救出ミニ遺伝子に結合されているので、候補遺伝子が変革し、腫瘍に発展するそのうちのいくつか救出メラノサイト、で表されます。メラノーマ開始とメラノーマ細胞特性に関する候補遺伝子の効果はメラノーマフリー生存曲線、浸潤アッセイは、抗体染色および移植アッセイを用いて測定することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
miniCoopRメソッドは、ゼブラフィッシュメラノサイトにおいて、目的の遺伝子の発現を可能にします。このアプローチは、ゼブラフィッシュmitfa遺伝子は細胞自律的役割を果たしているという事実を利用しています。このような理由から、miniCoopRベクトルによって救出メラノサイトは、それが物理的に結合されているミニ遺伝子と関心のある任意の遺伝子を含んでいるために確信?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
クリステン·クワンと後期カイビン本研究で使用したプラスミドの贈答用チェン;、抗体染色の支援のためのジェームズ·リスターとDavid Raible、およびのためのジェイムズNeiswender我々は、その研究室、これらの技術が最初に開発されたもので博士はレナードI.ゾンに感謝マイクロインジェクションビデオ。この作品は、CJCにNIHの助成金R00AR056899-03によって賄われていた
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
Referenzen
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