Dépistage du mélanome Modificateurs l'aide d'un modèle de tumeur Zebrafish Autochtone
Summary
Un moyen rapide pour le dépistage de modificateurs de mélanome en utilisant un modèle de tumeur poisson zèbre autochtone est présenté. Il tire profit du vecteur miniCoopR qui permet l'expression de gènes candidats de mélanome dans les mélanocytes. Une méthode pour obtenir des courbes de survie sans mélanome, un dosage invasion, un protocole pour la coloration d'anticorps de mélanocytes échelle et un essai de transplantation mélanome sont décrits.
Abstract
Les études génomiques de cancers humains ont révélé une mine de renseignements sur les gènes qui sont altérés dans les tumeurs 1,2,3. Un défi découlant de ces études est que de nombreux gènes sont altérés, et il peut être difficile de distinguer les altérations génétiques qui ont poussé la tumorigenèse de ceux qui se leva d'ailleurs lors de la transformation. Pour faire cette distinction, il est utile d'avoir un test qui peut mesurer quantitativement l'effet d'un gène modifié sur l'initiation de la tumeur et d'autres procédés qui permettent tumeurs à persister et à diffuser. Nous présentons ici un moyen rapide pour cribler un grand nombre de modificateurs de mélanome chez le poisson zèbre candidats à l'aide d'un 4 tumeurs autochtones modèle qui englobe les étapes nécessaires à l'initiation et le maintien du mélanome. Un réactif clé dans ce test est le vecteur miniCoopR, qui couple une copie de type sauvage de la spécification facteur mitfa mélanocytes à une cassette de recombinaison dans lequel la passerelle candidate melAnoma gènes peuvent être recombinées 5. Le vecteur a un minigène miniCoopR sauvetage mitfa qui contient le promoteur, le cadre de lecture ouvert et la région 3 'non traduite du gène de type sauvage mitfa. Il nous permet de faire des constructions à l'aide de longue durée cadres ouverts de lecture de modificateurs de mélanome candidats. Ces clones individuels peuvent ensuite être injecté dans la cellule unique Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); embryons de poisson zèbre mitfa (lf). Le vecteur miniCoopR obtient intégré par Tol2 médiée par transgénèse 6 et sauve mélanocytes. Parce qu'ils sont physiquement couplé à la minigène mitfa sauvetage, les gènes candidats sont exprimés dans les mélanocytes rescapés, dont certains vont transformer et se développer en tumeurs. L'effet d'un gène candidat à l'initiation du mélanome et des cellules de mélanome peut être mesurée à l'aide des courbes de survie sans mélanome, des essais d'invasion, la coloration d'anticorps et les essais de transplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode miniCoopR permet l'expression de gènes d'intérêt dans les mélanocytes de poisson zèbre. Cette approche tire parti du fait que le gène poisson zèbre mitfa agit cellulaire-autonome. Pour cette raison, les mélanocytes sauvés par le vecteur miniCoopR êtes certain de contenir le minigène et tout gène d'intérêt auquel il est couplé physiquement. Rescued mélanocytes sont clairement visibles et peuvent être obtenus chez les animaux qui ont été injectés dans des embryons unice…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Leonard I. Zon en laboratoire dont ces techniques ont été initialement développées; Kristen Kwan et la fin des années Chi-Bin Chien pour les dons de plasmides utilisés dans ce travail; James Lister et David Raible de l'aide pour coloration des anticorps, et James Neiswender pour la micro-injection vidéo. Ce travail a été financé par le NIH subvention R00AR056899-03 à CJC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
Referenzen
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