Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas
Summary
Dans cette publication, nous décrivons une procédure rapide et pratique pour les cellules acineuses pancréatiques primaires culture du pancréas murin isoler et. Cette méthode constitue une approche intéressante à étudier la physiologie des cellules pancréatiques exocrines normales / non transformé primaires fraîches.
Abstract
Ce protocole permet d'isoler rapidement (en moins de 1 h) de acini du pancréas murin, ce qui permet de les maintenir en culture pendant plus d'une semaine. Plus de 20 x 10 6 cellules acineuses peuvent être obtenus à partir d'un seul pancréas murin. Ce protocole offre la possibilité de traiter indépendamment jusqu'à 10 pancréas en parallèle. Car elle préserve l'architecture acinaire, ce modèle est bien adapté à l'étude de la physiologie du pancréas exocrine in vitro contrairement aux lignées cellulaires de tumeurs pancréatiques, qui affichent de nombreuses modifications génétiques résultant de la perte partielle ou totale de leur différenciation des cellules acineuses.
Introduction
Un problème fréquemment rencontré dans les laboratoires de recherche travaillant sur le tissu pancréatique exocrine est la difficulté de cultiver des cellules acineuses in vitro pour une période de temps suffisamment longue pour permettre une expérience à long terme.
Un facteur entravant le développement de ces systèmes de culture est la sensibilité intrinsèque du tissu pancréatique à la manipulation expérimentale en raison de la forte teneur en enzymes de la glycolyse, protéolytique et lipolytique, qui digèrent littéralement le tissu pancréatique quand ils sont libérés au cours de l'isolement des cellules pancréatiques.
Un deuxième facteur est la remarquable plasticité in vitro des cellules acineuses, qui ont tendance à perdre leurs caractéristiques sécrétoires et transdifférencier à d'autres cellules matures, telles que les cellules canalaires pancréatiques ou de cellules hépatocytes comme 1. In vitro, cette plasticité cellulaire varie avec les conditions expérimentales (tels que la composition du milieu de culture) 2 </sup> et présente un degré de complexité dans la conception des conditions de culture appropriées pour les cellules pancréatiques exocrines 1.
Plusieurs méthodes ont été développées pour l'isolement et la culture des cellules acineuses, premier du pancréas de porc Guinée 3-5. Initialement, ces protocoles impliqués digestion du tissu pancréatique avec de la collagénase, la chymotrypsine, et un cocktail de protéase, avec isolation ultime par dissociation mécanique vigoureuse. Les cellules pancréatiques isolés de cette manière affichées caractéristiques structurelles et fonctionnelles anormales, notamment une perte des structures apicales et des dommages importants à leurs récepteurs membranaires. Les cellules isolées sont restées viables pour seulement 1 ou 2 jours.
Préparation de la dispersion acini maintient leur architecture intra-et intercellulaires, en préservant les membranes cellulaires, ce qui limite les dommages aux récepteurs de surface, et d'améliorer ainsi la sécrétion exocrine en réponse aux sécrétagogues 6-8. Comme une result, cette méthode offre l'avantage majeur de l'extension de la viabilité des cellules acineuses à 7-10 jours in vitro. En outre, cette méthode est actuellement préférable à l'isolement des cellules acineuses 9-12 parce que l'entretien de contacts intercellulaires, y compris les assemblages de cellules par les jonctions communicantes, est un déterminant essentiel du pancréas phénotype des cellules acineuses exocrine 13.
Comme la dédifférenciation des cellules acineuses et leur transdifférenciation de cellules canalaires est l'un des mécanismes proposés pour la genèse des cancers du pancréas exocrine agressifs 14, les acini modèle dispersée est également un système adéquat pour étudier la plasticité du pancréas et de ses mécanismes moléculaires ultérieures. En outre, en combinaison avec l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés 15,16 et le développement des techniques de transfert de gènes (adénovirus 2 ou transduction lentiviraux, l'utilisation de nanoparticules, etc), ce modèle de cellule acineuse primaire in vitro peutêtre très utile pour déterminer comment divers dysfonctionnements génétiques affectent la régulation de la différenciation des cellules acineuses ou dédifférenciation et devraient permettre de mieux comprendre les événements moléculaires responsables de l'apparition d'une pancréatite, des lésions précancéreuses et des changements dans la plasticité cellulaire.
Isolation des dispersé acini est l'approche que nous utilisons dans notre laboratoire pour la culture des cellules acineuses du pancréas. Nous décrivons ici et de discuter de la méthode utilisée. Elle implique la dissociation enzymatique du tissu pancréatique (avec une collagénase bactérienne) couplé à une rupture mécanique sans dissociation des cellules acineuses. Alors que la plupart des protocoles impliquent la culture de la acini, soit en suspension ou sur des substrats plastiques spécialement traités, nous les cultivons en suspension que brièvement (pendant 24 heures), les semis plus tard sur les échafaudages de la matrice si la culture cellulaire prolongé est nécessaire.
Ce protocole permet l'isolement rapide (en moins de 1 h) de dispersion pancréas acini, durable pendant plus d'une semaine de culture. Il permet d'isoler plus de 20 x 10 6 cellules acineuses par le pancréas de souris. Sa simplicité permet de traiter indépendamment jusqu'à 10 pancréas en parallèle. En conservant l'architecture intra-et intercellulaires des acini et donc le phénotype des cellules acineuses des cellules primaires isolées, ce modèle constitue un système de choix pour l'étude des mécanismes de la transdifférenciation, comme tous les autres modèles pancréatiques exocrines actuellement disponibles sont dérivées de tumeurs pancréatiques affichant de nombreuses génétique altérations conduisant à la transformation cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une procédure pour isoler des cellules acineuses du pancréas. Cette méthode permet d'isoler plus de 20 x 10 6 cellules acineuses par animal en moins d'une heure. Merci à sa mise en œuvre simple et rapide (moins de 10 pancréas peuvent être traitées indépendamment par expérience en parallèle), ce protocole apparaît comme un bon compromis entre les méthodes d'isolation existants 3-5,9-12,17.
Les étapes critiq…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le personnel de AniCan (CRCL, Lyon) pour leur assistance technique aux soins des animaux. Ce travail a été financé par l'Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Program), la Ligue Nationale Contre le Cancer, l'Association pour la Recherche sur le Cancer, par l'Institut National du Cancer, et par des bourses de la Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), de l'Institut National du Cancer (JG), du Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche de la France (RMP et DFV) et de l'Association pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Referenzen
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