Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas
Summary
In dieser Veröffentlichung beschreiben wir eine schnelle und bequeme Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von primären Azinuszellen des Pankreas von dem murinen Bauchspeicheldrüse. Diese Methode stellt einen wertvollen Ansatz, um die Physiologie der frischen primären normal / transformierten exokrinen Pankreas-Zellen zu studieren.
Abstract
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Trennung (in weniger als 1 Stunde) von Maus Pankreasazini, so dass es möglich ist, sie in der Kultur für mehr als eine Woche halten. Mehr als 20 x 10 6 Azinuszellen aus einem einzigen murine Pankreas gewonnen werden. Dieses Protokoll bietet die Möglichkeit, unabhängig verarbeiten zu 10 Pankreas sind. Weil es acinar Architektur bewahrt, ist dieses Modell auch für das Studium der Physiologie des exokrinen Pankreas in vitro im Gegensatz zu Zelllinien aus Tumoren der Bauchspeicheldrüse, die viele genetische Veränderungen zu einer teilweisen oder vollständigen Verlust ihrer acinar Differenzierung angezeigt gegründet geeignet.
Introduction
Ein häufig auftretendes Problem für Forschungslabore auf exokrinen Pankreasgewebe ist die Schwierigkeit der Kultivierung Azinuszellen in vitro für einen bestimmten Zeitraum lang genug, um ein langfristiges Experiment erlauben.
Ein Faktor behindern Entwicklung solcher Systeme Kultur ist die intrinsische Empfindlichkeit von Pankreas-Gewebe experimentelle Manipulation durch den hohen Gehalt in glykolytischen, proteolytische und lipolytische Enzyme, die wörtlich verdauen Pankreasgewebe, wenn sie bei der Isolierung von pankreatischen Zellen freigesetzt werden.
Ein zweiter Faktor ist die bemerkenswerte in vitro Plastizität Azinuszellen, die ihre sekretorischen Eigenschaften verlieren und transdifferenzieren anderen reifen Zellen, wie Pankreasgangzellen oder Leber-ähnlichen Zellen 1. Neigen In vitro variiert diese Zellplastizität mit den experimentellen Bedingungen (z. B. Zusammensetzung des Kulturmediums) 2 </sup> und stellt ein gewisses Maß an Komplexität in der Gestaltung geeigneter Kulturbedingungen für exokrinen Pankreas-Zellen 1.
Mehrere Methoden zur Isolierung und Kultur der Azinuszellen, zuerst aus dem Meerschweinchen Bauchspeicheldrüse 3-5 entwickelt. Zunächst werden die Protokolle Verdauung von Pankreasgewebe mit Kollagenase, Chymotrypsin und einer Protease Cocktail beteiligt, mit ultimativen Isolierung durch kräftiges mechanische Dissoziation. Die Zellen der Bauchspeicheldrüse auf diese Weise isoliert angezeigt abnorme strukturelle und funktionelle Eigenschaften, insbesondere ein Verlust von apikalen Strukturen und erhebliche Schäden an ihrer Membran-Rezeptoren. Isolierte Zellen blieben nur für 1 oder 2 Tage lebensfähig.
Herstellung von dispergierten acini unterhält ihre intra-und interzellulären Architektur, die Erhaltung Zellmembranen, Schadensbegrenzung zu Oberflächen-Rezeptoren und damit die Verbesserung der exokrinen Sekretion in Reaktion auf Sekretagoga 6-8. Als result, bietet dieses Verfahren den großen Vorteil, sich Azinuszelltumoren Lebensfähigkeit zu 7-10 Tagen in vitro. Darüber hinaus ist dieses Verfahren derzeit Azinuszelltumoren Isolierung 9-12 da die Wartung der interzellulären Kontakte, darunter Zelle Kopplung durch Gap Junctions, ist eine wesentliche Determinante des exokrinen Pankreas Azinuszelltumoren Phänotyp 13 bevorzugt.
Da die Entdifferenzierung von Azinuszellen und ihre transdifferentiation zu duktalen Zellen ist einer der vorgeschlagenen Mechanismen für die Entstehung von aggressiven exokrinen Bauchspeicheldrüsenkrebs 14, ist die dispergierte acini Modell auch ein geeignetes System zur Pankreas-Plastizität und ihrer späteren molekularen Mechanismen zu studieren. Darüber hinaus in Kombination mit dem Einsatz von gentechnisch veränderten Tieren 15,16 und die Entwicklung von Gentransfer-Techniken (Adenovirus 2 oder lentiviralen Transduktion, Einsatz von Nanopartikeln, etc), diese in vitro primäre Azinuszelltumoren Modell kannsehr nützlich sein, zu bestimmen, wie verschiedene genetische Störungen der Regulierung der Azinuszelltumoren Differenzierung oder Entdifferenzierung beeinflussen und sollte ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge verantwortlich für das Auftreten von Pankreatitis, Krebsvorstufen und Veränderungen in Zellplastizität bieten.
Isolation von dispergierten acini ist der Ansatz, die wir in unserem Labor zu Kultur Azinuszellen des Pankreas. Wir beschreiben und diskutieren die Methode verwendet. Es handelt enzymatische Dissoziation von Pankreasgewebe (mit einer bakteriellen Collagenase) gekoppelt mechanisches Aufbrechen ohne Dissoziation Azinuszellen. Während die meisten Protokolle Kultivieren der Acini, beinhalten entweder in Suspension oder auf speziell behandeltem Kunststoff Substraten wachsen wir sie in Suspension nur kurz (24 Std.), Säen sie anschließend auf einer Matrix Gerüste, wenn längerer Zellkultur erforderlich.
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Trennung (in weniger als 1 Stunde) des Pankreas verteilt acini, nachhaltige für mehr als eine Woche in der Kultur. Es ermöglicht Isolierung von mehr als 20 x 10 6 Zellen pro Maus acinar Bauchspeicheldrüse. Die Einfachheit ist es möglich, unabhängig verarbeiten zu 10 Pankreas sind. Durch die Beibehaltung des intra-und interzellulären Architektur der Acini und damit die acinar Phänotyp der isolierten primären Zellen, stellt dieses Modell ein System der Wahl für die Untersuchung von Mechanismen transdifferentiation, wie alle anderen exokrinen derzeit verfügbaren Modelle von Tumoren der Bauchspeicheldrüse Anzeige von vielen genetischen abgeleitet Änderungen, die zu zellulärer Transformation.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von pankreatischen Azinuszellen. Dieses Verfahren macht es möglich, mehr als 20 x 10 6 Zellen pro Tier acinar in weniger als 1 h zu isolieren. Dank seiner schnellen und einfachen Implementierung (so viele wie 10 Bauchspeicheldrüsen unabhängig pro Experiment parallel verarbeitet werden), wird dieses Protokoll als guter Kompromiss zwischen bestehenden Isolation Methoden 3-5,9-12,17.
Kritische Schritte…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitarbeitern der AniCan (CRCL, Lyon) für ihre technische Unterstützung bei der Tierpflege. Diese Arbeit wurde vom Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Program), die Ligue Nationale Contre le Cancer, von der Association pour la Recherche sur le Cancer, der vom Institut National du Cancer, und durch Stipendien unterstützt von der Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), aus dem Institut National du Cancer (JG), aus dem Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche in Frankreich (RMP und DFV) und der Vereinigung pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Referenzen
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