בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר
Summary
בפרסום זה, אנו מתארים הליך מהיר ונוח לבידוד ותאי לבלב acinar העיקריים culturing מהלבלב העכברי. שיטה זו מהווה גישה רבת ערך כדי ללמוד את הפיסיולוגיה של תאי לבלב אקסוקרינית רגילים / untransformed העיקריים טריים.
Abstract
פרוטוקול זה מאפשר בידוד מהיר (בשעה פחות מ 1) לacini לבלב העכברי, כך שניתן לשמור אותם בתרבות ליותר משבוע אחד. ניתן לקבל יותר מ -20 10 6 תאי acinar x מלבלב עכברי אחת. פרוטוקול זה מציע את האפשרות לעבד באופן עצמאי רבים כמו 10 לבלב במקביל. משום שהיא משמרת את ארכיטקטורת acinar, מודל זה מתאים גם ללימוד הפיסיולוגיה של הלבלב אקסוקרינית במבחנה בניגוד לשורות תאים הוקמו מגידולים בלבלב, המציגים שינויים גנטיים רבים וכתוצאה מכך האובדן חלקי או מוחלט של בידול acinar שלהם.
Introduction
בעיה נתקל לעתים קרובות למעבדות מחקר עובדים על רקמת לבלב אקסוקרינית היא הקושי בטיפוח תאים במבחנה acinar לתקופת הזמן ארוך מספיק כדי לאפשר ניסוי לטווח ארוך.
גורם אחד מונע פיתוח של מערכות תרבות כזו הוא הרגישות הפנימית של רקמת לבלב למניפולציה ניסויית בשל תכולה הגבוהה באנזימי glycolytic, פרוטאוליטי, וlipolytic, שפשוטו כמשמעו לעכל את רקמת הלבלב כאשר הם משתחררים בבידוד של תאי לבלב.
גורם שני הוא יוצא דופן בפלסטיות במבחנה של תאי acinar, אשר נוטים לאבד את התכונות שלהם והפרשת transdifferentiate לתאים בוגרים אחרים, כגון תאי לבלב או תאי ductal דמויי hepatocyte 1. במבחנה, פלסטיות תא זה משתנה עם תנאי הניסוי (כמו הרכב בינוני תרבות) 2 </sup> ומציג את מידת המורכבות לתוך העיצוב של תנאי התרבות מתאימים לתאי לבלב אקסוקרינית 1.
כמה שיטות פותחו לבידוד ולתרבות של תאי acinar, ראשון מלבלב חזיר ים 3-5. בתחילה, פרוטוקולים אלה מעורבים עיכול של רקמת לבלב עם collagenase, chymotrypsin, וקוקטייל פרוטאז, עם בידוד אולטימטיבי על ידי ניתוק מכאני נמרץ. תאי הלבלב שבודדו בדרך זו מוצגים מאפיינים מבניים ותפקודיים תקינים, בעיקר אובדן של מבני apical ונזק משמעותי לקולטניים הקרום שלהם. תאים מבודדים נותרו מעשיים עבור רק 1 או 2 ימים.
הכנת התפזרה acini שומר על אדריכלות הפנים ואינטר שלהם, שמירה על ממברנות תאים, הגבלת נזק לקולטנים על פני, ובכך לשפר את ההפרשה אקסוקרינית בתגובה לsecretagogues 6-8. כresuLT, שיטה זו מציעה יתרון הגדול של הארכת כדאיות תא acinar ל7-10 ימים במבחנה. יתר על כן, בשיטה זו היא כיום העדיפה בידוד תא acinar 9-12 בגלל התחזוקה של קשר אינטר, כולל תא צימוד על ידי צמתים פער, היא הקובע חיוני של פנוטיפ תא acinar הלבלב אקסוקרינית 13.
כמו טשטוש ההבדלים של תאי acinar וtransdifferentiation לתאי ductal הוא אחד המנגנונים המוצעים לראשיתו של סרטן הלבלב אקסוקרינית אגרסיבי 14, התפזר acini המודל הוא גם מערכת נאותה ללמוד פלסטיות לבלב והמנגנונים המולקולריים הבאים שלה. יתר על כן, בשילוב עם שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטי 15,16 והפיתוח של טכניקות העברת גנים (2 adenoviral או התמרה lentiviral, שימוש של חלקיקים, וכו '), זה במודל תא acinar העיקרי מבחנה יכוללהיות מאוד שימושי בקביעת אופן תפקוד גנטי שונים משפיע על הוויסות של התמיינות תאי acinar או טשטוש הבדלים, ואמור לספק הבנה טובה יותר של האירועים המולקולריים האחראים להתפרצות של דלקת בלבלב, נגעים טרום סרטניים, ושינויים בפלסטיות תא.
בידוד של פזורים acini הוא הגישה שאנו משתמשים במעבדה שלנו לתאי לבלב acinar תרבות. אנחנו כאן לתאר ולדון בשיטה. זה כרוך בניתוק האנזימטית של רקמת לבלב (עם collagenase חיידקים) מצמידים את השיבוש מכאני ללא ניתוק של תאי acinar. בעוד שרוב הפרוטוקולים כרוכים culturing acini, או בהשעיה או במצעי פלסטיק שטופלו במיוחד, אנו לגדל אותם בהשעיה לזמן קצר בלבד (במשך 24 שעות), זריעתם אחר כך על גבי פיגומי מטריצה אם נדרשת תרבית תאים ממושכת.
פרוטוקול זה מאפשר בידוד מהיר (בשעה פחות מ 1) התפזר לבלב ACINI, בר קיימא ליותר משבוע אחד בתרבות. זה מאפשר בידוד של יותר מ 20 x 10 6 תאים לכל acinar לבלב עכבר. הפשטות שלו מאפשרת לעבד באופן עצמאי רבים כמו 10 לבלב במקביל. על ידי שמירה על אדריכלות הפנים ואינטר של acini ולכן הפנוטיפ acinar של תאים ראשוניים מבודדים, מודל זה מהווה מערכת של בחירה עבור המחקר של מנגנוני transdifferentiation, כמו כל דגמי הלבלב אקסוקרינית האחרים הזמינים כיום נגזרים מגידולים בלבלב מוצגות רבים גנטיים שינויים שהובילו להפיכה סלולרית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך לבידוד תאי acinar לבלב. שיטה זו מאפשרת לבודד יותר מ 20 x 10 6 תאים לכל חיה acinar בשעה פחות מ 1. הודות ליישום המהיר ופשוט שלו (כמה שרק 10 לבלב יכול להיות מעובד באופן עצמאי לניסוי במקביל), פרוטוקול זה מופיע כפשרה טובה בין שיטות בידוד 3-5,9-12,17 ק?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לצוות של AniCan (CrCl, ליון) לקבלת הסיוע הטכני שלהם עם טיפול בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי דה לה סנטה et de la Recherche Médicale (תכנית Avenir INSERM), Ligue Nationale Contre le הסרטן, על ידי אגודת pour la משוכלל ונדיר sur le הסרטן, על ידי המכון הלאומי לסרטן du, ועל ידי מלגות מ Ligue Nationale Contre le הסרטן (JG), מהמכון הלאומי לסרטן du (JG), ממיניסטר de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche של צרפת (RMP וDFV) ומאיגוד pour la משוכלל ונדיר sur le הסרטן ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Referenzen
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
