Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных
Summary
В этой публикации мы описываем быстрый и удобный способ выделения и культивирования первичных панкреатических ацинарных клетках мышиной поджелудочной железы. Этот метод представляет собой ценный подход к изучению физиологии свежих первичных нормальных / нетрансформированному экзокринных клеток поджелудочной железы.
Abstract
Этот протокол обеспечивает быстрое выделение (менее чем за 1 час) мышиного ацинусов поджелудочной железы, что позволяет поддерживать их в культуре в течение более одной недели. Более 20 × 10 6 клеток ацинарных могут быть получены из одной мышиной поджелудочной железы. Этот протокол дает возможность независимо обрабатывать целых 10 поджелудочной железы параллельно. Потому что он сохраняет ацинарным архитектуре, эта модель хорошо подходит для изучения физиологии поджелудочной железы внешней секреции в пробирке в отличие от клеточных линий устанавливается с опухолями поджелудочной железы, которые отображают многие генетические изменения в результате частичной или полной потери их ацинарным дифференциации.
Introduction
Часто встречается проблема для научно-исследовательских лабораториях работают над экзокринной ткани поджелудочной железы является сложность выращивания ацинарных клеток в пробирке в течение времени, достаточного, чтобы позволить долгосрочный эксперимент.
Одним из факторов, препятствующих развитию таких систем культура представляет собой характеристическую чувствительность ткани поджелудочной железы экспериментальных манипуляций из-за высокого содержания в гликолитических, протеолитические и липолитические ферменты, что буквально переваривают ткани поджелудочной железы, когда они выпущены при выделении клеток поджелудочной железы.
Вторым фактором является замечательным в пробирке пластичность ацинарным клеток, которые, как правило, теряют свои характеристики секреторную и трансформироваться в другие зрелые клетки, такие как клетки протоков поджелудочной железы или гепатоцитов-подобные клетки 1. В пробирке, эта ячейка пластичности зависит от условий эксперимента (такие, как культура состав среды) 2 </вир> и вводит степени сложности в конструкцию соответствующие условия культивирования для экзокринных клеток поджелудочной железы 1.
Некоторые методы были разработаны для выделения и культуры ацинарных клетках, первый из поджелудочной железы морской свинки 3-5. Первоначально, эти протоколы участвуют пищеварения ткани поджелудочной железы с коллагеназы, химотрипсин и протеазы коктейль, с конечной изоляции интенсивного механического диссоциации. Панкреатических клеток, выделенных таким образом, отображается ненормальное структурные и функциональные характеристики, в частности, потери апикальных структур и значительный ущерб их мембранными рецепторами. Изолированные клетки остаются жизнеспособными в течение только 1 или 2 дней.
Подготовка дисперсных ацинусах поддерживает их внутри-и межклеточных архитектуры, сохранение клеточных мембран, ограничивая повреждение поверхностных рецепторов, и, следовательно, улучшение экзокринной секреции в ответ на секрецию 6-8. Как RESULt, этот метод предлагает основным преимуществом продления жизнеспособности клетки ацинарным до 7-10 дней в пробирке. Кроме того, этот метод настоящее время предпочтительно, чтобы ацинарных изолятор 9-12, потому что обслуживание межклеточных контактов, в том числе клетки связи по щелевых контактов, является важной детерминантой экзокринных ацинарных клеток поджелудочной железы фенотип 13.
Как дедифференцировка ацинарных клеток и их трансдифференцировки в клетках протоков является одним из предлагаемых механизмов для генезиса агрессивных экзокринной рак поджелудочной железы 14, диспергированные ацинусов модель также адекватной системы для изучения пластичности поджелудочной железы и ее последующего молекулярные механизмы. Кроме того, в сочетании с использованием генетически модифицированных животных 15,16 и разработка методов переноса генов (аденовирусных 2 или лентивирусов трансдукции, использование наночастиц, и т.д.), то в пробирке модель первичной клетки ацинарных можетбыть очень полезны в определении того, как различные генетические дисфункции влияют на регулирование ацинарным дифференцировки клеток или дедифференцировки и должны обеспечить более глубокое понимание молекулярных событий, ответственных за возникновение панкреатита, предраковых поражений, а также изменения в клеточной пластичности.
Выделение дисперсных ацинусах такой подход мы используем в нашей лаборатории культуры ацинарных клетках поджелудочной железы. Мы здесь описания и обсуждения используемого метода. Она включает в себя ферментативной диссоциации ткани поджелудочной железы (с бактериальной коллагеназы), соединенный с механическим разрушением без диссоциации ацинарных клетках. Хотя большинство протоколов, включающих в культивировании ацинусов, либо в суспензии или на специально обработанных пластиковых подложках, мы выращиваем их в суспензии лишь кратко (за 24 часа), посев их впоследствии на матрицу лесов если длительное культуре клеток не требуется.
Этот протокол позволяет быстром отрыве (менее чем за 1 час) дисперсных поджелудочной ACINI, устойчивое для более чем одной недели в культуре. Это позволяет выделить более 20 × 10 6 ацинарных клеток на мышь поджелудочной железы. Его простота позволяет обрабатывать независимо целых 10 поджелудочной железы параллельно. Путем поддержания внутри-и межклеточном архитектуры ацинусов и, таким образом ацинарных фенотип выделенных первичных клетках, эта модель представляет собой систему выбора для изучения трансдифференцировки механизмы, как и все другие модели экзокринной поджелудочной железы в настоящее время являются производными от опухолей поджелудочной железы отображения многих генетических изменения, ведущие к трансформации клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе, мы опишем способ выделения ацинарных клетках поджелудочной железы. Этот способ делает возможным выделить более 20 × 10 6 ацинарных клеток на животное в менее чем 1 час. Благодаря быстрой и простой реализации (целых 10 поджелудочной железы может быть независимо обраб…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников AniCan (циклическое, Лион) за техническую помощь в уходе за животными. Эта работа выполнена при поддержке Национального института де-ла-Здоровье и де ла Recherche Médicale (INSERM Avenir Программе), Ligue Nationale Contre Le Рака, Ассоциация Pour La Recherche сюр-ле-Рака, в Национальном институте рака Ду, и стипендии Ligue Nationale Contre Le рака (JG), Национального Института Рака Du (JG), от Ministère De L'Enseignement Высший ET DE La Recherche Франции (РМП и DFV) и Ассоциации Pour La Recherche сюр-ле-Рака ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
Referenzen
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
