Isolation Manuel des cellules souches du tissu adipeux de Lipoaspirates humaines

Summary

En 2001, des chercheurs de l'UCLA ont décrit l'isolement d'une population de cellules souches adultes, les cellules appelé ou CSA souches du tissu adipeux, du tissu adipeux. Cet article décrit l'isolement des CSA de lipoaspirates utilisant un protocole de digestion enzymatique manuel à l'aide de la collagénase.

Abstract

En 2001, des chercheurs de l'Université de Californie, Los Angeles, décrit l'isolement d'une nouvelle population de cellules souches adultes à partir de tissu adipeux que Liposuctioned qu'ils appellent d'abord les cellules de lipoaspirat transformés ou des cellules de l'APL. Depuis lors, ces cellules souches ont été renommés que les cellules souches dérivées de tissu adipeux ou CSA et ont continué pour devenir l'un des plus populaires des populations les cellules souches adultes dans les domaines de la recherche sur les cellules souches et la médecine régénérative. Des milliers d'articles décrivent maintenant l'utilisation des CSA dans une variété de modèles animaux de régénération, y compris la régénération osseuse, réparation des nerfs périphériques et de l'ingénierie cardiovasculaire. Des articles récents ont commencé à décrire la multitude d'utilisations pour CSA dans la clinique. Le protocole indiqué dans cet article décrit la procédure de base pour la main et enzymatique isoler CSA de grandes quantités de lipoaspirates obtenus à partir des procédures cosmétiques. Ce protocole peut être facilement agrandie ou réduite à accommodmangé le volume du lipoaspirat et peut être adapté pour isoler à partir de tissu adipeux ASCs obtenus par plasties abdominales et d'autres procédures similaires.

Introduction

En 2001, une population présumée de cellules souches multipotentes à partir de tissu adipeux a été décrite dans la revue Tissue Engineering ^1. Ces cellules ont été donné le nom de cellules transformés lipoaspirat ou PLA en raison de leur dérivation à partir de tissu de lipoaspirat traités obtenus par la chirurgie esthétique. Le procédé d'isolement décrit dans cet article est basée sur des stratégies existantes enzymatiques pour l'isolement de la fraction stroma vasculaire (SVF) à partir de tissu adipeux ^2. Le SVF a été définie comme une transformation minimale population de globules rouges, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, des pericytes et des pré-adipocytes qui restent encore à adhérer à un substrat de culture de tissus ^{2, 3.} La culture de cette SVF dans le temps est proposé d'éliminer bon nombre de ces populations de cellules contaminantes et entraîner, une population de fibroblastes adhérent. Ces fibroblastes ont été identifiés dans la littérature pour les 40 dernières années comme étant pré-adipocytes. Toutefois, notre groupe de recherche a démontré que ces cellules possédaient mésodermique multipotency et renommés de la population SVF adhérente que les cellules de l'APL. Des études ultérieures par de nombreux autres groupes de recherche ont ajouté à ce potentiel, suggérant à la fois endodermique et potentiels ectodermiques (pour revue, voir ^4). Depuis ce temps, de nombreux termes supplémentaires pour ces cellules ont été publiés dans la littérature. Afin de fournir un certain type de consensus, le terme de cellules souches du tissu adipeux ou CSA a été adopté lors de la ^deuxième conférence annuelle IFATS 2. En tant que tel, l'ASC terme sera utilisé dans cet article.

Le protocole décrit dans cet article est une procédure relativement simple qui nécessite un équipement de laboratoire standard et utilise des réactifs simples, telles que la phospho-solution saline tamponnée, des réactifs de milieux de culture de tissus standard et de la collagénase. Il peut produire un grand nombre de CSA en fonction de la quantité de départ de volume du tissu adipeux et c ultérieurulture temps. Cependant, le traitement d'une telle quantité de tissu adipeux peut présenter certains problèmes physiques qui peuvent être atténués à un degré en utilisant ce protocole. En outre, ce protocole ne nécessite tissus stériles installations de culture et les hottes de biosécurité approuvées, ce qui nécessite l'utilisation d'une installation de culture de tissus approuvé. Cette exigence peut également diminuer l'utilité de la population de l'ASC dans les applications cliniques, sauf s'ils sont isolés dans de bonnes pratiques de fabrication des installations (GMP) approuvés conçus pour l'isolement et l'expansion des matériaux pour une utilisation clinique. Comme alternative, les systèmes automatisés qui peuvent isoler CSA dans un système fermé dans la salle d'opération permettrait d'éviter cette question clé et permettre l'utilisation immédiate des CSA sans qu'il soit nécessaire pour l'expansion in vitro ultérieure. A ce jour, il existe six systèmes automatisés qui sont commercialement disponibles pour l'isolement de cellules à partir de tissu humain. Ces systèmes peuvent permettre d'isoler unnombre important des CSA de grandes quantités de tissu adipeux immédiatement après sa récolte. Ces CSA pourraient alors être réintroduits dans le patient pour une variété de fins de régénération sans que le patient jamais avoir à quitter la salle d'opération. En plus de ce protocole décrivant l'isolement d'emploi des CSA, un protocole pour l'isolement automatique des CSA à l'aide du système Celution est également donnée dans un article associé.

Protocol

Le protocole présenté ici décrit l'isolement d'emploi des CSA de lipoaspirates obtenues par des procédures cosmétiques par digestion enzymatique et centrifugation différentielle. Ce protocole a été publiée dans le génie tissulaire de la revue en 2001 1, où les cellules résultantes ont été appelés cellules lipoaspirat transformés ou des cellules de l'APL en raison de leur isolement lipoaspirates. Toutefois, le terme cellule PLA a maintenant été remplacé par le terme de ce…

Representative Results

Le contour du protocole décrit ci-dessus, un procédé enzymatique manuel pour l'isolement d'un SVF à partir d'un grand échantillon de lipoaspirat de volume. Dans ce SVF sont nombreuses populations de cellules, y compris l'ASC. De nombreuses études suggèrent que la culture de cette SVF dans des conditions de culture de tissus standards choisira pour une population de fibroblastes adhérent susceptible d'être composé principalement de type ASC. Conformément à cela, nous avons montré, en util…

Discussion

Le tissu adipeux pour l'isolement des CSA peut prendre de nombreuses formes: à partir de morceaux de tissus solides obtenus par résection ou lipoplasty de petits morceaux obtenus soit par extraction de la seringue ou lipoplastie assistée par aspiration (c'est à dire la liposuccion). Que plus de cellules SVF (et donc CSA) peuvent être obtenus à partir d'échantillons de tissu adipeux résection ou aspiration n'est pas clair que les études contradictoires ont été présentées ^{16, 17….}

Materials

			Reagent
DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)	Mediatech Cellgro	10-013-CV	with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin/Streptomycin	Mediatech Cellgro	30-002-CI	10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin
Amphotericin B	Mediatech Cellgro	30-003-CF	250 μg/ml amphotericin B
10X PBS (Phospho-buffered Saline)	Mediatech Cellgro	25-053-CI	without calcium, without magnesium
Trypsin/EDTA	Mediatech Cellgro	20-031-CV	0.25 % trypsin/2.21mM EDTA
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum)	Sigma	C2674	crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated	Gemini Bioproducts	100106	USDA source, heat inactivated
10 ml serological pipettes	Genesee Scientific	12-104
25 ml serological pipettes	Genesee Scientific	12-106
50 ml polypropylene centrifuge tubes	Genesee Scientific	21-106
100 mm tissue culture dishes	Genesee Scientific	25-202
150 mm tissue culture dishes	Genesee Scientific	25-203
500 ml Stericup Filter Units	Millipore	SCGPU05RE	PES membrane, 0.22 μm pore
Cell strainers	FisherBrand	22-363-549	100 μm nylon mesh
dexamethasone – water soluble	Sigma	D-2915
L-ascorbic-acid 2 phosphate	Sigma	A-8960
β-glycerophosphate disodium salt	Sigma	G-9422	also known as glycerophosphate
insulin	Sigma	I-6634	made from bovine pancreas
indomethacin	Sigma	I-7378
apo-transferrin	Sigma	T-4382
TGFβ1	R&D Systems	240-B-002	recombinant human
Oil Red O	Sigma	O-0625
Alcian Blue	Sigma	A-5268
Silver nitrate	Sigma	S-0319
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	30525-89-4	supplied as a 16 % stock
			[header]
			Equipment Needed
Class II A/B Biosafety hood	Thermo Scientific		ensure hood has vacuum lines for aspiration
Benchtop centrifuge	Hermle Labnet	Z383	Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	S52602Q	5-10L capacity, capable of 37 C
Automated Pipette Aids	Drummond Pipette Aid XL	4-000-105
CO2 Incubator	Thermo Scientific	Forma 310	direct heat or water jacketed