Руководство Выделение полученные из жировой ткани стволовые клетки из человека Lipoaspirates
Summary
В 2001 году исследователи из UCLA описано изоляция популяции взрослых стволовых клеток, называется полученные из жировой ткани стволовые клетки или ИСС, из жировой ткани. В этой статье описываются изоляцию ИСС от lipoaspirates использованием ручной, ферментативный протокол пищеварения с использованием коллагеназы.
Abstract
В 2001 году исследователи из Университета Калифорнии в Лос-Анджелесе, описано выделение новой популяции взрослых стволовых клеток из liposuctioned жировой ткани, что они изначально называется, Обработанные липоаспирата клеток или PLA клетки. С тех пор, эти стволовые клетки были переименованы в жировой ткани стволовых клеток или ИСС и пошли дальше, чтобы стать одним из самых популярных групп населения взрослые стволовые клетки в области исследования стволовых клеток и регенеративной медицины. Тысячи статей теперь описано использование ИСС в различных регенеративных животных моделях, в том числе регенерации костной ткани, периферической нервной ремонта и сердечно-сосудистых техники. Последние статьи начали описывают множество применений для ИСС в клинике. Протокол показано в этой статье описывается основная процедура для вручную и ферментативно изоляции ИСС от больших количеств lipoaspirates полученных из косметических процедур. Этот протокол может быть легко масштабируется вверх или вниз для Accommodели объем липоаспирата и могут быть адаптированы, чтобы изолировать ИСС из жировой ткани, полученные через abdominoplasties и других подобных процедур.
Introduction
В 2001 году предполагаемый население мультипотентными стволовых клеток из жировой ткани была описана в журнале Tissue Engineering 1. Эти клетки получили название Обработано липоаспирата или PLA клетки из-за их выводе из обработанного липоаспирата ткани, полученные с помощью косметической хирургии. Метод изоляции описано в этой статье было основано на существующих ферментативных стратегий изоляции стромальных сосудистой фракции (SVF) от жировой ткани 2. SVF была определена как минимально обработанного населения эритроцитов, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры, перицитами и преадипоцитов, которые еще придерживаются культуры ткани подложки 2, 3. Культивирование этого SVF течением времени предлагается устранить многие из этих загрязняющих клеточных популяций и привести к прикрепленной, фибробластов населения. Эти фибробласты были определены в литературе за последние 40 лет, как быть предварительноадипоциты. Тем не менее, наша исследовательская группа показала, что эти клетки обладают мезодермального мультипотентность и переименовал приверженцем SVF население в НОАК клеток. Последующие исследования многих других исследовательских групп добавили к этому потенциалу, предполагая, как энтодермальных и эктодермальные потенциалов (см. обзор 4). С того времени, многочисленные дополнительные условия для этих клеток появились в литературе. В целях обеспечения некоторый тип консенсуса, термин полученные из жировой ткани стволовые клетки или ИСС была принята на й ежегодной конференции 2 IFATS. Таким образом, термин ASC будет использоваться в этой статье.
Протокол, описанный в этой статье, относительно простая процедура, которая требует стандартный лабораторного оборудования и использует простые реагенты, такие как фосфо-солевом буфере, стандартных для культивирования тканей СМИ реагентов и коллагеназы. Он может производить большое количество ИСС в зависимости от количества исходного объема ткани жировой и последующее Culture время. Однако обработка такого большого количества жировой ткани может представить некоторые физические проблемы, которые могут быть уменьшены до такой степени, используя этот протокол. Кроме того, этот протокол требует стерильных культуры ткани объектов и утвержденные капюшоны биобезопасности, возникает необходимость использования утвержденного культуры объекте ткани. Это требование может также уменьшить полезность населения ASC в клинической практике, если они не изолированы в надлежащей производственной практики (GMP), одобренные устройства, предназначенные для изоляции и расширения материалов для клинического использования. В качестве альтернативы, автоматизированные системы, которые могут изолировать ИСС в замкнутой системе в операционной избежал бы этого ключевого вопроса и создать условия для немедленного использования ИСС без какой-либо необходимости в последующей экспансии в пробирке. На сегодняшний день существует шесть автоматизированных систем, которые доступны в продаже для выделения клеток из тканей человека. Эти системы могут сделать возможным изолироватьЗначительное число ИСС из большого количества жировой ткани сразу после его урожай. Эти ИСС может затем быть вновь в организм пациента для различных восстановительных целях без пациента покидая операционную. В дополнение к этому протоколу, описывающей ручной изоляцию ИСС, протокол для автоматизированного выделения ИСС использованием Celution система также приведены в сопутствующей статье.
Protocol
Representative Results
Discussion
Жировая ткань для выделения ИСС может прийти во многих формах: от цельных кусков ткани, полученных с помощью резекции или липосакции на более мелкие куски, полученных с помощью либо извлечения шприца или всасывания при содействии липосакции (т.е. липосакции). Если больше СФДВ клетк…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность и поблагодарить тех дополнительных научных кадров, которые способствовали развитию описанного протокола и его изоляции ИСС, в том числе: д-р Х. Петер Лоренц, доктор медицинских наук, доктор Хироши Muzuno, доктор медицинских наук, доктор Джерри Хуанг, MD , д-р Адам Кац, доктор медицинских наук, доктор Уильям Футрелл, доктор медицинских наук, доктор Жун Чжан, доктор стоматологии, кандидат наук, доктор Лариса Родригес, доктор медицинских наук, доктор Зени Альфонсо, доктор философии, и д-р Джон Фрейзер, кандидат наук. Результаты, представленные финансировались, в частности, путем исследовательских грантов от Национального института здоровья, в том числе NIAMS и NIDCR институтов.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| [header] | |||
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
Referenzen
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J., Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user’s guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D’Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
