Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates
Summary
Im Jahr 2001 beschrieben Forscher an der UCLA die Isolierung einer Population von adulten Stammzellen, sogenannte Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, aus dem Fettgewebe. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung des ASC aus lipoaspirates mit einem manuellen, enzymatische Verdauung mit Kollagenase-Protokoll.
Abstract
Im Jahr 2001, Forscher an der University of California, Los Angeles, beschrieben die Isolierung einer neuen Population von adulten Stammzellen aus Fettgewebe liposuctioned, die sie anfangs genannt Verarbeitete Lipoaspirate Cells oder PLA-Zellen. Seitdem haben diese Stammzellen aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen oder ASC umbenannt und gegangen auf einer der beliebtesten adulten Stammzellen-Populationen in den Bereichen Stammzellforschung und der regenerativen Medizin zu werden. Tausende von Artikeln werden nun die Verwendung von ASC in einer Vielzahl von Tiermodellen regenerative, einschließlich der Knochenregeneration, periphere Nervenreparatur und Herz-Kreislauf-Engineering. Aktuelle Artikel haben begonnen, die Vielzahl von Anwendungen für ASC in der Klinik zu beschreiben. Die in diesem Artikel gezeigten Protokoll beschreibt das grundlegende Verfahren für manuell und enzymatisch ASC Isolierung von großen Mengen von lipoaspirates von kosmetischen Verfahren erhalten. Dieses Protokoll kann leicht nach oben oder unten skaliert werden, um Unterkunftsaß das Volumen der lipoaspirate und kann auf ASC aus dem Fettgewebe durch abdominoplasties ähnlichen Verfahren erhalten zu isolieren.
Introduction
Im Jahr 2001 wurde eine mutmaßliche Bevölkerung von multipotenten Stammzellen aus Fettgewebe in der Zeitschrift Tissue Engineering 1 beschrieben. Diese Zellen wurden die Namen Verarbeitete Lipoaspirate-oder PLA-Zellen aufgrund ihrer Ableitung aus verarbeitet lipoaspirate Gewebe durch kosmetische Chirurgie erhalten gegeben. Die in diesem Artikel beschriebenen Isolationsmethode wurde auf bestehende enzymatische Strategien für die Isolierung des Stroma-Kreislauf-Fraktion (SVF) aus dem Fettgewebe 2 basiert. Die SVF wurde als minimal verarbeiteten Population von roten Blutzellen, Fibroblasten, Endothelzellen, glatten Muskelzellen, Perizyten und Präadipozyten, die noch nicht zu einem Gewebekultur-Substrat 2, 3 haften definiert. Kultivierung dieser SVF über die Zeit wird vorgeschlagen, beseitigen viele dieser kontaminierenden Zellpopulationen und führen zu einer haftenden, Fibroblastenpopulation. Diese Fibroblasten wurden in der Literatur für die letzten 40 Jahre nicht als zuvor identifiziert wordenAdipozyten. Allerdings zeigten unsere Forschungsgruppe, dass diese Zellen besaß mesodermalen Multipotenz und als PLA Zellen umbenannt haft SVF Bevölkerung. Nachfolgende Studien von zahlreichen anderen Forschungsgruppen haben auf dieses Potential gegeben, was darauf hindeutet, sowohl endodermale und ektodermalen Potentiale (für eine Übersicht siehe 4). Seit dieser Zeit wurden zahlreiche zusätzliche Bedingungen für diese Zellen in der Literatur erschienen. Um irgendeine Art von Konsens zu schaffen, wurde der Begriff Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC in der 2. Jahres IFATS Konferenz angenommen. Als solche wird der Begriff ASC in diesem Artikel verwendet werden.
Die in diesem Artikel beschriebenen Protokoll ist ein relativ einfaches Verfahren, das Standard-Laborausrüstung erfordert und verwendet einfache Reagenzien wie Phosphor-Kochsalzlösung, Standard-Gewebekulturmedien und Reagenzien Kollagenase. Es kann abhängig von der Menge des Ausgangs Fettgewebe Volumen und anschließende c eine große Anzahl von ASCs erzeugenulture Zeit. Jedoch kann die Verarbeitung solcher großen Mengen von Fettgewebe einige physikalische Probleme, die bis zu einem Grad unter Verwendung dieses Protokolls begrenzt werden könnten präsentieren. Darüber hinaus hat dieses Protokoll erfordern sterile Gewebekultureinrichtungen und genehmigt Biosicherheit Hauben, wodurch die Verwendung eines zugelassenen Gewebekultur-Anlage erforderlich. Diese Anforderung kann auch den Nutzen der Bevölkerung zu verringern ASC in der klinischen Anwendung, sofern sie nicht in der guten Herstellungspraxis (GMP) zugelassenen Anlagen zur Isolierung und Ausdehnung von Materialien für den klinischen Einsatz konzipiert isoliert werden. Als Alternative würde automatisierte Systeme, die ASC in einem geschlossenen System im Operationssaal zu isolieren, können diese Schlüsselfrage zu vermeiden und ermöglichen den sofortigen Einsatz von ASC, ohne dass für die anschließende In-vitro-Expansion. Bisher gibt es sechs automatisierten Systemen, die für die Isolation von Zellen aus menschlichem Gewebe sind im Handel erhältlich. Diese Systeme können machen es möglich, ein isolierenerhebliche Anzahl von ASC von großen Mengen an Fettgewebe unmittelbar nach ihrer Ernte. Diese ASC konnte dann in den Patienten für eine Vielzahl von regenerativen Zwecken ohne dass der Patient jemals den Operationssaal verlassen wieder eingeführt werden. Zusätzlich zu diesem Protokoll die manuelle Trennung der ASC beschreibt, ist ein Protokoll für die automatisierte Isolierung von ASC mit dem Celution-System auch in einem Begleitartikel gegeben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fettgewebe für die Isolierung von ASC kann in vielen Formen: von festen Stücken von Gewebe durch Resektion oder Fettabsaugen, um kleinere Stücke entweder durch Extraktion oder Spritze Saug-assistierte Fettabsaugung (Liposuktion dh) erhalten wird. Ob mehr SVF Zellen (und damit ASC) aus resezierten oder Fettgewebe abgesaugt Proben erhalten werden, ist unklar, wie widersprüchliche Studien vorgestellt wurden 16, 17. Es ist möglich, dass entweder Form von Fettgewebe ist mehr als geeignet für die Iso…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten zu erkennen und zu danken, diese zusätzliche Mitarbeiter in der Forschung, die zur Entwicklung der beschriebenen Protokoll und seine Isolierung von ASC, einschließlich beigetragen: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Alfonso Zeni, PhD, und Dr. John Fraser, PhD. Die vorgestellten Ergebnisse wurden finanziert, zum Teil durch Forschungsstipendien von den National Institutes of Health, einschließlich der NIAMS und NIDCR Institute.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| [header] | |||
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
Referenzen
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